HPLC法測定陝北地區甜菊葉中甜菊糖苷含量
祁春雷,劉月霞,高 強,文 鈺
(榆林合力生物科技有限公司,陝西榆林 719000)
摘 要:采用HPLC法測定陝北地區佳縣、定邊、米脂3個產地的甜菊葉樣品中甜菊糖苷含量。通過超聲提取得到甜菊葉中甜菊糖苷樣品液,使用高效液相色譜儀檢測甜菊糖苷樣品液。采用C18反相色譜柱(250.0 mm×4.6 mm,5 m),流動相為乙腈-磷酸鈉緩衝液(30∶70,體積比),梯度洗脫,流速1 mL/min,柱溫40 ℃,測定波長210 nm,進樣量10 μL。結果表明,HPLC法操作簡便、高效快速、穩定性好。
關鍵詞:甜菊葉;甜菊糖苷;高效液相色譜法
甜菊葉屬菊科,又名甜菊葉、甜草,是一種多年生草本植物,原產於南美洲巴拉圭巴西交界的阿曼山脈。甜菊糖是從甜菊葉中提取出的含甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B等9種甜味成分的四環二萜類化合物,其中,瑞鮑迪苷A甜菊苷含量最高,甜味品質最好,甜度是蔗糖甜度250~350倍,而熱量僅為蔗糖的1/300。2008年末甜菊糖被美國食品藥品管理局(FDA)批準使用,被譽為世界“第3類糖源”[1]。甜菊糖苷因其甜度高、熱量低、無毒性、耐高溫、耐酸堿和水溶性好,攝入人體後不被吸收,不產生熱量等優點,被稱為是天然、健康的新型無熱量代糖產品,是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。可用於糖果、糕點、飲料、固體飲料、油炸小食品、調味料和蜜餞等食品加工領域。
目前關於甜菊葉中甜菊糖苷的測定方法有質量法、堿量法、分光光度法和薄層色譜法等。本試驗擬采用高效液相色譜法對佳縣、定邊、米脂3個產地的甜菊葉樣品進行甜菊糖苷檢測,並分析甜菊葉裏甜菊糖苷混合物中不同甜菊糖苷的含量,以期為甜菊葉質量評價提供科學依據。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
3份相同品種甜菊葉樣品采於佳縣、米脂、定邊等地的農業企業或種植基地。乙腈、磷酸二氫鈉、磷酸,均為色譜純。磷酸鈉緩衝液(pH2.6):稱取1.20 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4),溶於800 mL水中,用磷酸調節pH至2.6。流動相:乙腈-磷酸鈉緩衝液(30∶70,體積比)。
甜菊苷標準品:甜菊苷含量(質量分數,以幹基計)≥99.0%。瑞鮑迪苷A標準品:瑞鮑迪苷A含量(質量分數,以幹基計)≥99.0%。其他7種糖苷標準品(質量分數,以幹基計)≥99.0%:瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊雙糖苷。
1.2 儀器與設備
高效液相色譜儀(日本島津公司產品);紫外檢測器;電子天平;超聲波清洗儀(上海傑理科技有限公司產品)。
1.3 實驗方法
1.3.1 色譜條件
C18反相色譜柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈:磷酸鈉緩衝液=30∶70,梯度洗脫,流速1mL/min;柱溫40 ℃;紫外檢測器波長為210 nm,進樣量10 μL。
1.3.2 標準品溶液製備
將甜菊糖苷標準品置於105 ℃幹燥箱中烘2 h,精密稱取5 mg,溶液溶解並定容至10 mL,搖勻置於棕色瓶中。即配成濃度為0.5 mg/mL的標準品溶液,經0.45 μm微孔濾膜過濾,備用。吸取10 μL標液進樣,並記錄。
1.3.3 供試樣品溶液的製備
將3份甜菊葉樣品置於105 ℃幹燥箱中烘2 h,粉碎後分別稱取1 g放入燒杯中加入100 mL純淨水置於超聲波清洗器中60 ℃超聲提取1 h,高速離心20 min,收集過濾液並經0.45 μm微孔濾膜過濾,得到備用樣品。
2 結果與分析
2.1 精密度實驗結果
取上述佳縣供試樣品溶液連續進樣3次,進樣量為10 μL,記錄峰麵積,計算甜菊苷(Stevioside,ST)、瑞鮑迪苷A(Rebaudioside A,RA)、瑞鮑迪苷B(Rebaudioside B,RB)、瑞鮑迪苷C(Rebaudioside C,RC)、瑞鮑迪苷D(Rebaudioside D,RD)、瑞鮑迪苷F(Rebaudioside F,RF)、杜克苷A(DulcosideA,DA)、甜茶苷(Rubusoside,RUB)和甜菊雙糖苷(Steviolbiosid,SB)的相對標準偏差(Relative Standard Deviation,)值分別為2.15%、2.23%、1.98%、2.13%、2.02%、1.89%、1.99%、2.10%和2.11%,表明HPLC法測定甜菊糖苷含量精密度良好[2]。
2.2 甜菊葉中甜菊糖苷含量
佳縣、定邊、米脂甜菊葉中甜菊糖苷的色譜圖如圖1~圖3所示,具體含量見表1。甜菊葉中ST和RA含量占甜菊糖苷總量的比例是評價甜菊葉質量好壞的重要指標。表1結果顯示,3個地區的總苷含量在15.20%~17.51%,其中米脂的總苷含量最高,定邊的總苷含量最低[3]。不同地區各種成分含量差別比較大的是RA含量和RUB含量,其中,RA含量米脂最高、佳縣次之、定邊最低;RUB含量米脂最高、定邊次之、佳縣邊最低,米脂的RUB含量是佳縣的4倍[4]。
影響甜菊葉中甜菊糖苷含量的主要因素是溫度、光照、生長周期[5]。定邊甜菊葉種植在風力發電設備下,種植基地相對於佳縣和米脂海拔高、溫度低,導致甜菊葉的生長周期縮短,RA含量和總苷含量較低。而米脂種植基地在太陽能發電光板下,地勢平坦、溫度較其他兩地高,但光照不足,影響了甜菊葉的質量。佳縣是大麵積、大規模平地種植,正常光照和溫度,其RA占總苷含量最高。
3 結論
HPLC法測定甜葉菊中甜菊糖苷含量精密度良好,且能同時測定甜葉菊中甜菊糖苷總量及9種成分,包括甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷的含量,為不同地區甜葉菊質量評價提供了一種操作簡便、高效快速的檢測方法。
參考文獻
[1]羅慶雲,印敏,陳玉江,等.酸性氧化鋁前處理甜葉菊葉片甜菊糖苷分析樣品的質譜驗證[J].中國糖料,2019,41(4):24-29.
[2]安徽蚌埠惠農甜葉菊高科技發展有限公司.一種大量獲得甜葉菊葉片產物甜菊糖苷RM的方法:201810683979.5[P].2018-11-30.
[3]洪維廉,陳睦傳,李裏焜,等.甜葉菊甙研究的進展[J].植物科學學報,1987,5(3):211-218.
[4]明光市大全甜葉菊專業合作社.一種提高甜葉菊中甜菊糖苷含量的方法:106631356A[P].2017-05-10.
[5]鄧佐,夏延斌,王曉亮.簡易HPLC法測定甜菊葉中甜菊糖苷[J].農產品加工·學刊(下),2013(10):14-15.
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