陳少華，肖幸宇，劉鳳銀*

(廣東第二師範學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303)

摘 要：β-內酰胺酶是一類可以催化水解β-內酰胺類抗生素的水解酶，基於該原理，不法商販為了躲避β-內酰胺類抗生素的檢查，人為向乳及乳製品中加入β-內酰胺酶，營造“無抗奶”的假象，增加了乳品行業的安全風險。本文從乳及乳製品中β-內酰胺酶的穩定性、殘留危害、殘留現狀和檢測方法進行闡述，通過分析當前常用的檢測方法的優劣勢，包括微生物分析法、儀器檢測方法、快速檢測方法，旨在為乳及乳製品中β-內酰胺酶的檢測方法提供參考。

關鍵詞：乳及乳製品;β-內酰胺酶;檢測方法;殘留

β-內酰胺酶是一類水解酶，可以催化水解β-內酰胺類抗生素，導致抗生素失去抑菌活性。鑒於此，一些不法商販為了追求經濟利益，沒有嚴格遵守休藥期的規定進行采奶，導致牛奶中抗生素的殘留，為了躲避檢查，人為添加β-內酰胺酶，營造“無抗奶”的假象。β-內酰胺酶缺少安全性評價，其加入增加了乳品行業安全風險，因此針對乳及乳製品中β-內酰胺酶的檢測非常重要。目前尚未製定國家檢測標準，僅在《生乳中β-內酰胺酶的測定》

(NY/T 3313—2018)中規定了生乳中β-內酰胺酶的測定方法——杯碟法[1]。本文主要從乳及乳製品中

β-內酰胺酶的穩定性、殘留危害、殘留現狀和檢測方法進行闡述，分析常用檢測方法的優勢與劣勢，旨在為選擇乳及乳製品中β-內酰胺酶的檢測方法提供參考依據。

1 乳及乳製品中β-內酰胺酶的穩定性、殘留危害和殘留現狀

1.1 乳及乳製品中β-內酰胺酶的穩定性

β-內酰胺酶具有較強的耐熱性和酸堿耐受性，市售牛奶大多采用巴氏滅菌或超高溫瞬時滅菌，貯存於低溫或常溫條件下，在該加工工藝和貯存條件下並不能使牛奶中β-內酰胺酶完全失活，仍會有β-內酰胺酶殘留。

範美婧等[2]探究了牛奶中β-內酰胺酶的穩定性，采用青黴素酶活性檢測試劑盒，從牛奶的保存時間、滅菌方法和酸堿處理3個方麵對β-內酰胺酶活性的影響進行研究。實驗結果表明，低溫條件對酶活性影響不大，≤4 ℃貯存一周仍能檢出各個濃度的β-內酰胺酶;常溫條件下，牛奶放置時間越長，酶活性越小，且減少程度與貯存溫度呈正相關關係，25 ℃和37 ℃條件下牛奶樣品貯存一周，酶活性降低;長時間高溫加熱會掩蓋低濃度β-內酰胺酶的檢出，巴氏滅菌和超高瞬時滅菌等常規滅菌方法並不能使β-內酰胺酸堿完全失活;市售酸奶pH為4～5，酸堿處理均會抑製低濃度β-內酰胺酶的活性，但未完全失活，當β-內酰胺酶濃度>3 U/mL時仍能檢出，pH為6和7時最為穩定。

1.2 乳及乳製品中β-內酰胺酶的殘留危害

①乳及乳製品中β-內酰胺酶添加來源不明確，缺乏安全評價數據，這對我國乳及乳製品的質量管理埋下了安全隱患;②β-內酰胺酶水解抗生素生成的青黴噻唑酸分解產物具有細胞毒性，抑製細胞繁殖能力，殘留產物會在肝髒蓄積，成為潛在的健康風險;③非法加入β-內酰胺酶掩蓋抗生素超標的現實，不僅極易造成奶製品市場抗生素使用泛濫，而且增加了耐藥基因的水平和縱向傳播風險，使人們抵抗傳染病能力下降、腸道菌群紊亂，從而對人體健康造成危害。

1.3 乳製品中β-內酰胺酶的殘留現狀

2008年衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用性物質名單》中將β-內酰胺酶列為重點監控指標。各個地區的乳及乳製品檢測中均有不同程度的β-內酰胺酶殘留，部分地區β-內酰胺酶的檢出率較高，因此加強乳及乳製品中殘留的β-內酰胺酶監管力度，定期執行檢測任務至關重要。

齊欣等[3](2021)采用杯碟法對遼寧省原料乳進行檢測，結果186批次樣品中β-內酰胺酶的檢出率為12.4%;邱正勇(2019)等[4]采用膠體金檢測法對河南省鄭州市每月采集的60份生乳進行檢測，結果β-內酰胺酶檢出率波動較大，部分高達73.3%;秦婧[5](2016)對陝西省149份生鮮乳進行檢測，其陽性檢出率為11.4%;候海燕(2015)[6]對江蘇省淮安市149份牛奶樣品進行檢測，其陽性率為16.8%。

2 乳及製品中β-內酰胺酶常用檢測方法

2.1 微生物分析法

杯碟法檢測牛奶中β-內酰胺酶的方法已經較為成熟，該法采用對青黴素敏感的藤黃微球菌，利用舒巴坦能夠特異性抑製β-內酰胺酶的活性的性質，以青黴素作為對照，通過比較加入舒巴坦和未加入舒巴坦產生的抑菌圈大小，從而間接測定牛奶中是否含有β-內酰胺酶。

《生乳中β-內酰胺酶的測定》(NY/T 3313—2018)農業行業標準規定了生乳中β-內酰胺酶測定方法杯碟法[1]，其檢出限為生牛乳4 U/mL、生羊乳3 U/mL;劉暘等[7]研究兩種添加藤黃微球菌的方法對牛奶中β-內酰胺酶檢出限的影響，方法1製備成15 cm厚的單層培養基，方法2製備成雙層培養基。實驗發現方法2其抑菌圈邊緣更加清晰，便於觀察和測量，該方法靈敏度更高，其檢出限在0.000 05～0.00 01 U/mL。

杯碟法是我國乳品行業認可的常用微生物檢測方法，成本低，適用大批量檢測，檢測結果相對準確，但實驗過程煩瑣，周期長，容易出現假陽性現象，不能進行定量實驗，對環境要求較高，不適用現場檢測，具有一定的局限性。

2.2 儀器檢測方法

2.2.1 高效液相色譜法

β-內酰胺酶能酶解青黴素，且青黴素濃度的減少量與酶活性呈線性關係，因此可以通過測定青黴素濃度減少量來間接檢測β-內酰胺酶的含量。基於此原理，李雪芳等[8-9]通過離心除脂、無水乙醇除蛋白，采用高效液相色譜法測定了奶粉中β-內酰胺酶的含量，當β-內酰胺酶濃度在0.2～1.4 mg/L，與青黴素鉀的減少量呈現較好的線性關係，回收率89.0%～95.0%，相對標準偏差3.0%～3.5%。

高效液相色譜法因其高靈敏度和高回收率得到廣泛應用，但樣品前處理較為煩瑣，檢測成本高，常用於實驗室檢測，不適合現場高通量檢測。

2.2.2 分光光度法

利用β-內酰胺酶水解β-內酰胺類抗生素，其主要產物青黴噻唑酸具有還原性的性質，李濱等[10]建立檢測牛奶中β-內酰胺酶的硫酸銅-紫外分光光度法，按照1∶1的比例加入三氯乙酸，輔以冷凍離心沉澱蛋白後，其最低檢出限為5 U/mL;戴興德等[11]基於青黴素分子的硫原子具有還原性，能將Fe3+還原成Fe2+，與[Fe(CN)6]3-生成可溶性普魯士藍，而酶水解產物和堿水解產物青黴素噻唑酸均不能與Fe3+反應，具有選擇性。利用該原理，建立檢測牛奶中β-內酰胺酶含量的普魯士藍顯色光度法，該方法耗時短，僅35 min，β-內酰胺酶在4～24 U/mL與吸光值呈線性關係，檢出限為0.32 U/mL，加標回收率為98.8%～101.2%。

分光光度法具有設備簡單、維修方便、操作簡單、實用性廣、準確度和精密度好等優點，但提高其方法的選擇性和降低檢出限，一直是遏待解決的問題。

2.3 快速測定方法

β-內酰胺酶能水解青黴素，通過間接競爭法快速測定與β-內酰胺酶反應後殘留青黴素的含量，從而間接檢測出β-內酰胺酶的含量。

利用青黴噻唑酸能還原Cu2+為Cu+，與2，2-聯喹啉生成紫紅色絡合物的性質，施春煜[12]將醋酸纖維素膜浸泡於亞銅試劑溶液中，真空幹燥製成顯色層，將過濾層、顯色層和吸收材料粘貼在基板上，製成檢測牛奶中β-內酰胺酶半定量快速測試紙，再結合分光測定儀製作標準比色卡，該方法最低檢出限為6 U/mL，相對誤差範圍為7.51%～15.38%;張威等[13]采用Charm Rosa β-內酰胺酶試劑盒對150批乳及乳製品進行批量篩查，其檢出限為4 U/mL，假陽性率為2%，靈敏度100%，特異性97.8%，具有高靈敏度和特異性，符合試劑盒快速篩查檢測要求。

快速測試法具有較高的靈敏度，操作簡單，檢測速度快，基本能滿足大批量篩選的要求，但容易出現假陽性，需結合杯碟法進一步驗證。

參考文獻

[1]李欣南,韓鐫竹,蘇崴藝.生鮮乳中β-內酰胺酶微生物法檢測[J].中國乳品工業,2015,43(3):57-59.

[2]範美婧,陳媛,蔡興航,等.不同處理方式對乳中β-內酰胺酶穩定性的影響[J].中國乳品工業,2017,45(4):8-10.

[3]齊欣,曲世超,薛偉鋒,等.遼寧省原料乳中β-內酰胺酶的檢測及結果分析[J].中國奶牛,2021(3):49-52.

[4]邱正勇,吳玲玲,李豔芬,等.鄭州市生乳中微生物汙染狀況和β-內酰胺酶基線數據調查[J].中國衛生檢驗雜誌,2019,29(17):2166-2168.

[5]秦婧,張莉,舒靜,等.陝西省生鮮乳中β-內酰胺酶的檢測與結果分析[J].中國乳品工業,2016,44(9):61-64.

[6]侯海燕,劉靚,劉純成,等.淮安市市售乳製品中β-內酰胺酶殘留狀況調查[J].江蘇預防醫學,2015,26(6):92-93.

[7]劉暘,張麗宏,房玉國,等.杯碟法中藤黃微球菌的添加方式對生鮮乳中β-內酰胺酶檢出限的影響[J].中國乳品工業,2021,49(2):39-41.

[8]李雪芳,馮衛強,戴絢麗.高效液相色譜法檢測乳粉中活性β-內酰胺酶含量[J].飲料工業,2015,18(3):10-12.

[9]郝苗苗.乳及乳製品中β-內酰胺酶檢測方法研究[J].中國飼料,2020(7):95-98.

[10]李濱,張俊傑,徐潔,等.牛奶中β-內酰胺酶檢測方法的研究[J].現代食品,2021,27(11):186-189.

[11]戴興德,鄭小芳,火文琴,等.普魯士藍顯色光度法測定牛奶中β-內酰胺酶的含量[J].中國生物製品學雜誌,2021,34(2):207-212.

[12]施春煜.牛奶中β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙的研究[J].農產品加工,2016(23):11-13.

[13]張威,薑連閣.乳及乳製品中β-內酰胺酶快速檢測試劑盒的比較研究[J].現代食品,2018(5):113-116.