李坤全，王春雷

(聊城市檢驗檢測中心，山東聊城 252000)

摘 要：選取方便麵及其料包為研究對象，建立了固相萃取-超高效液相色譜-質譜聯用法(SPE-UPLC-MS/MS)測定方便麵及其料包中5種罌粟殼生物堿的檢測方法，樣品經MCX固相萃取柱淨化，C18柱分離，甲醇和0.1%甲酸水為流動相，梯度洗脫，電噴霧電離正離子模式，多反應監測(MRM)進行定性定量分析，二級質譜進行確證，考察了不同提取液、淨化方式和色譜柱對實驗回收率的影響。結果表明：罌粟堿、那可丁和蒂巴因在0.01～10.0 μg/L，嗎啡和可待因在 0.1 ～ 100.0 μg/L 範圍內線性關係良好，線性係數（r2）＞ 0.999 8，檢出限為 0.21 ～ 1.24 μg/kg，定量限為 0.66 ～ 4.65 μg/kg，回收率為 72.02% ～ 110.09%，相對標準偏差為（RSD）為 1.05% ～ 4.25%。該方法淨化效果好，檢出限低，回收率高，精密度好，可應用於方便麵及其料包中 5 種罌粟殼生物堿的檢測。

關鍵詞：罌粟殼生物堿;固相萃取;超高效液相色譜-質譜聯用;基質效應;方便麵

Determination of Five Papaveric Alkaloids in Instant Noodles and its Ingredients Package by SPE-UPLC-MS/MS Method

LI Kunquan, WANG Chunlei

(Liaocheng Inspection and Examination Center, Liaocheng 252000, China)

Abstract: In this research, we selected instant noodles and its ingredients package as research object and established one determination method of five papaveric alkaloids of this object by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry coupled with solid-phase extraction (SPE-UPLC-MS/MS). The samples were cleaned up by MCX solid-phase extraction column and separated on C18 column using 0.1% formic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase with gradient elution, and the target compounds were analysed by electrospray ionization in positive mode with multiple reaction monitoring (MRM) for qualitative and quantitative analysis. The secondary mass spectrometry was used to confirming. This paper also investigated the effects of different extraction solutions, purification methods and chromatographic columns on the experimental recovery. The results suggest that papaverine, noscapine, and thebaine showed a good linearity in the range of 0.01～10.0 μg/L, morphine and codeine also showed a good linearity in the range of 0.1～100.0 μg/L, and the linear coefficient

(2) was >0.999 8. Limits of detections were in the range of 0.21～1.24 μg/kg and limits of quantitations were in the range of 0.66～4.65 μg/kg. The recoveries of alkaloids in instant noodles were from 72.02% to 110.09% with relative standard deviations of 1.05%～4.25%. The method has the advantages of good purification effect, low detection limit, low quantitative limit, high recovery rate and good precision, and can be applied to the determination of 5 kinds of papaverium alkaloids in instant noodles and their packages.

Keywords: papaveric alkaloids; solid-phase extraction; ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; matrix effects; instant noodles

罌粟殼係成熟罌粟去掉果實之後幹燥的果殼，其含有嗎啡(Morphine)、可待因(Codeine)、那可丁(Noscapine)、罌粟堿(Papaverine)和蒂巴因(Thebaine)等生物堿[1]，這些成分有斂肺止咳、鎮靜止痛、止瀉等功效[2]，但也有一定的成癮性，一些不良商家正是看到了這一點，才鋌而走險，將罌粟殼加入火鍋底料、烹調香料、羊肉湯、麻辣燙、醬鹵肉和飲料等食品中，以此來吸引“回頭客”。如果長期食用這些食品會使人出現虛汗、乏力、麵黃肌瘦、精神萎靡等[3]。2009年監管部門規定罌粟殼禁止添加於火鍋食品中，2011年又將禁用的產品類別範圍擴大為“火鍋底料及小吃類食品”，並列出主要成分為“罌粟堿、那可汀、可待因、嗎啡”，從而有效保證人們飲食安全。

目前罌粟殼生物堿的主要檢測方法有光譜法(如分光光度法)、色譜法(如薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法)、電泳法、免疫分析法、質譜法(如氣相色譜質譜法、液相色譜質譜法)等方法。這其中分光光度法隻能對嗎啡定性和半定量測定;薄層色譜法易受幹擾;電泳法重現性差，多作為輔助檢測方法;免疫分析法抗體保存時間有限，容易產生交叉反應;氣相色譜法和氣相色譜質譜法不適於難揮發、強極性和易熱解化合物的檢測，而液質聯用法靈敏度、準確度高，精密度好，可進行痕量分析，各組分無需基線分離。

現有文獻報道中研究者已經對醬鹵肉[4]、火鍋底料[5]、羊肉湯及湯料[6]、烹調香料[7]、藥酒[8]和植物油[9]中5種罌粟殼生物堿成分進行了檢測，但是還有一種備受消費者喜愛且容易越吃越上癮的食品——方便麵至今沒有檢測報道，故本研究從方便麵切入，以固相萃取為淨化手段，結合UPLC-MS/MS建立了方便麵及其料包中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因5種生物堿的檢測方法，準確度高、檢出限低，二級質譜可有效避免假陽性的出現。

1 材料與方法

1.1 材料

方便麵：均來自於政府組織的農村地區流通環節世界杯賽程預測專項抽檢中的方便麵樣品，其中B品牌、J品牌和K品牌各抽出10個，共計30個待測樣品，並按照GB/T 5009.1—2003的要求製備樣品。

1.2 試劑

甲醇(CH3OH，HPLC級)和乙腈(ACN，HPLC級)均購買於OCEANPAK公司;鹽酸(分析純，AR)和氨水(AR)均購買於煙台遠東精細化工有限公司;正己烷(農殘級)：天津市光複精細化工研究所;甲酸(HPLC級)：天津市大茂化學試劑廠;乙酸(HPLC級)：西隴科學股份有限公司;鹽酸罌粟堿(1 μg/mL)、鹽酸那可丁(1 μg/mL)、蒂巴因(1 μg/mL)、嗎啡(50 μg/mL)、可待因(50 μg/mL)、嗎啡-D3(100 μg/mL)和可待因-D3均購買於MEDJEN LLC公司;MCX固相萃取柱(150 mg，6 mL)：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的製備

混合標準工作液：分別精密移取1 μg/mL罌粟堿、那可丁和蒂巴因溶液和50 μg/mL嗎啡和可待因溶液各1.00 mL於10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為100 µg/L和嗎啡、可待因濃度為5 mg/L的混合標準品溶液。

混合內標工作液：分別精密移取嗎啡-D3和可待因-D3內標物質(100 μg/mL)各1.00 mL於100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到嗎啡-D3、可待因-D3的濃度均為1.0 μg/mL的混合內標溶液。

1.3.2 質譜條件

多反應監測模式(MRM)，正離子電噴霧離子化(ESI+)，離子化電壓為5 500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣壓力為35 psi，霧化氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為50 psi，各化合物的檢測離子對、碰撞能量(Collision Energy，CE)、去簇電壓(Declustering Potential，DP)、射入電壓(Entrance Potential，EP)和碰撞室射出電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)等質譜參數見表1。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Luna® Omega C18(2.1 mm×100 mm，1.6 µm);流動相;含 0.1% 甲酸水溶液為 A 相，甲醇為 B 相;梯度洗脫程序：0 ～ 1.00 min，70%A;1.00 ～ 3 min，70%A → 10%A;3 ～ 5 min，10%A; 5 ～ 5.1 min，100%A → 70%A;5.1 ～ 6.5 min，70%A;流速：0.4mL/min;進樣量：10 µL。

1.3.4 樣品前處理

準確稱取樣品2 g(精確至0.01 g)於50 mL離心管中，依次加入40 μl內標工作液和20 mL ACN-0.1 mol/L HCl(1∶4，V/V)溶液，渦旋混勻5 min，超聲10 min，低溫(4 ℃)8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至50 mL離心管中，加入20 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋振蕩2 min，低溫10 000 r/min離心3 min，下層液體待淨化。取MCX固相萃取柱，使用前一次用6 mL水、6 mL ACN活化，準確移取5 mL下清液上柱，保持流速每滴1～2 s，然後依次用6 mL水、6 mL ACN淋洗去除雜質，用6 mL 5%(/)氨水乙腈洗脫，收集洗脫液於15 mL離心管中，40 ℃氮吹至幹，加入1.00 mL CH3OH-0.1%甲酸水(3∶7，V/V)定容，過0.22 μm濾膜後上機測試。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

5種生物堿均為堿性化合物，酸性環境中易溶於水，因此可用酸性溶液進行提取，提取液用有機溶劑萃取去除脂溶性雜質，再用固相萃取柱進行深度淨化，最後洗脫液旋幹複溶過膜上機測定。本實驗分別用 0.1 mol/L HCl 溶液、1% 醋酸溶液、ACN-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 1，V/V)溶 液、ACN-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)溶液、CH3OH-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 1， V/V)溶 液 和 CH3OH-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)溶液進行加標回收，結果表明(圖 1)，使用 0.1mol/L HCl 溶液和 1% 醋酸溶液進行提取時 5 種化合物的回收率基本上低於 50%，回收效果較差，當使用 ACN-0.1mol/L HCl(1 ∶ 1，V/V)溶 液、CH3OH-0.1 mol/L HCl(1∶1，V/V)溶液和CH3OH-0.1 mol/L HCl(1∶4， V/V)溶液提取時嗎啡的回收效果較差，回收率小於50%，這可能是由於在前處理過程中出現乳化現象，當使用 ACN-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)溶液進行提取時回收率均大於 80%，雖有乳化現象的發生，但可以通過低溫高速離心盡量降低損失，故本實驗最終將 ACN-0.1mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)作為提取液。

前處理過程中還有一項任務就是盡可能地去除溶劑效應和基質效應，食品樣品種類多，基質複雜，要建立一個適合所有樣品的高效統一的淨化方法實屬不易，因此實驗過程中提取液淨化後氮吹去除乙腈，然後再用初始流動相複溶，以此來減小溶劑效應;同時為更好地降低基質效應，實驗過程中不同品牌的方便麵使用不同的基質標準曲線。此外對於淨化方式而言，DB 31/2010—2012[10]和BJS 201802[11]中加無水醋酸鈉、無水硫酸鎂的主要作用是除水和促進生物堿從水相轉移到有機相，提取淨化效率有待研究[12-13];還有學者[14]采用QuEChERS法淨化，此法的確簡便快捷，但是PSA能強力吸附嗎啡，C18可吸附罌粟堿、蒂巴因、嗎啡、可待因導致回收率較低，提取後直接進樣會使基質幹擾物增多;固相萃取是較為常見的淨化手段，文獻報道[15]使用C18柱嗎啡無保留，HLB柱嗎啡和那可丁無保留，由於5種生物堿極性較大，故可使用MCX和PCX來淨化，實驗中對比二者的淨化效果，MCX略優於PCX，故最終采用MCX來淨化。

2.2 線性範圍、檢出限和定量限

實驗中以基質匹配的方法繪製標準曲線，將空白樣品提取液作為稀釋液，精確配製0.01～10.0 μg/L的罌粟堿、那可丁和蒂巴因的混合標準工作液，0.1～100.0 μg/L的嗎啡和可待因的混合標準工作液(其中含嗎啡-D3和可待因-D3均為10.0 μg/L)，各取5 μL上機測試，以標準品濃度為橫坐標，罌粟堿、那可丁和蒂巴因以峰麵積為縱坐標，嗎啡和可待因以峰麵積和內標物峰麵積比值為縱坐標，繪製標準曲線，得到的線性方程、線性係數和線性範圍見表2，結果表明罌粟堿、那可丁和蒂巴因在 0.01 ～ 10.00 μg/L 範圍內，嗎啡和可待因在 0.1 ～ 100.0 μg/L 範圍內線性關係良好，線性係數(r2)> 0.999 8，這表明該法適用於方便麵中 5 種罌粟殼類生物堿的檢測。一般以信噪比(S/N) 為 3 的含量定為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N) 為 10 的含量定為方法的定量限(LOQ)，5 種生物堿的檢出限和定量限見表2，檢出限介於0.21～1.24 μg/kg，定量限介於 0.66 ～ 4.65 μg/kg。

2.3 回收率和精密度

取空白樣品(檢測結果為陰性的樣品)，每份稱取2.0 g樣品，分別加入低、中、高3個水平(其中罌粟堿、那可丁和蒂巴因的添加濃度為0.10 μg/kg、0.20 μg/kg和0.40 μg/kg，嗎啡和可待因的添加濃度為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg)的標準溶液適量，每個濃度平行6份，按照1.3.4的方法進行前處理製得待測溶液，上機檢測含量，計算回收率，結果顯示(表3)，在3種不同品牌的方便麵中5種生物堿的回收率為72.02%～110.09%，相對標準偏差為(RSD)為1.05%～4.25%，說明該方法能夠滿足不同方便麵樣品的分析要求。具體來看嗎啡和可待因的回收率(85.19%～110.09%)要明顯優於罌粟堿、那可丁和蒂巴因的回收率(72.02%～107.21%)，這可能是因為嗎啡和可待因采用內標法定量，能夠很好地減小基質效應，而其餘罌粟堿、那可丁和蒂巴因雖然采用基質匹配標曲外標法定量，但還會或多或少的受到基質幹擾，而這一點在3種化合物0.10 μg/kg下的加標回收時尤為明顯，因此以後的實驗中可以采取其他方式(如在線稀釋、開發內標定量法等)近一步降低基質效應。

2.4 二級質譜及其譜庫建立

在實際工作中，由於食品樣品基質複雜，傳統質譜分析的MRM工作模式很容易產生基質效應，導致保留時間和離子比率有偏差，或出現“假峰”，產生假陽性，幹擾判斷。為克服此弊端，實驗利用SCIEX複合質譜QTRAP係統獨有的複合掃描模式MRM-IDA-EPI，即三重四極杆和線性離子阱的預掃描方式(Survey Scan)相結合觸發增強離子掃描(EPI)，可以在一針進樣的同時獲得MRM色譜峰和增強型二級碎片，其中MRM色譜峰用來定量，EPI不同能量符合二級譜圖形成“指紋”圖譜，實現搜庫和確證，確保檢測結果的準確性。實驗過程中取5種生物堿和兩種內標物溶液單標(濃度為5 μg/L)依次進樣，MRM-IDA-EPI采集模式，將得到的標準譜圖和化合物信息加入數據庫中，建立譜庫並逐一對假陽性樣品進行比對確認。

2.5 實際樣品測定

采用本研究構建方法對政府抽檢的3個品牌的方便麵30個樣品進行5種罌粟殼生物堿的定性篩查和定量分析，結果顯示有3個樣品(K品牌2個、B品牌1個)在保留時間1.15 min時嗎啡兩離子對出峰，4個樣品(K品牌2個、J品牌2個)那可丁有一個離子對(414.2/220.2)出峰，4個樣品(J品牌3個、K品牌2個)可待因有一個離子對(300.2/165.2)出峰，考慮到保留時間和離子比率等因素，采集這11個樣品的二級質譜圖，並與標準譜圖進行對比，結果顯示11個樣品3種成分的匹配度(Purity)均小於50%，為陰性樣品。

3 結論

本研究通過使用MCX柱對方便麵樣品進行提純淨化，並結合UPLC-MS/MS的MRM和MRM-IDA-EPI采集模式建立了方便麵中5種罌粟殼生物堿的分析方法，方法檢出限低，靈敏度高，準確度高，精密度好。采用超高效液相色譜，可在6.5 min內完成一個樣品的分析，大大提高了分析效率，同時建立了5種生物堿的二級質譜圖庫，能有效快速地對陽性樣品進行篩查，確保結果的準確性。本研究不但為罌粟殼生物堿檢測方法國標的製定提供了參考，而且為依法打擊食品中非法添加罌粟殼行為提供有利依據，保障消費者的合法利益。

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作者簡介：李坤全(1978—)，男，山東聊城人，本科，工程師。研究方向：世界杯賽程預測 與質量。

王春雷(1988—)，男，山東聊城人，碩士，工程師。研究方向：世界杯賽程預測 與質量檢測。