馬慧娟，高　宏，牛鵬飛，梅　嬋

(江蘇省理化測試中心，江蘇南京 210042)

摘　要：為了探索新建立的一種多重PCR對動物源性食品檢測的適用性，實驗采用豬、牛、羊、雞和鴨肉混合的方法，用多重PCR對混合肉樣進行檢測，以驗證多重PCR的檢測的可行性和有效性。通過對市售20種樣品提取DNA進行多重PCR和單一PCR的5種動物源性成分檢測結果比對，進一步比較兩種方法檢測結果的不同。結果表明，建立的多重PCR可同時檢測出2種、3種、4種和5種動物源性成分，采用多重PCR法和單一PCR法對20種市售樣品分別檢測，兩種方法結果無差異，表明所建立的多重PCR法可檢測豬、牛、羊、雞和鴨5種動物源性成分。

關鍵詞：動物源性食品;多重PCR;單一PCR;適用性

應用PCR方法檢測食品中動物源性成分的研究和標準有很多，目前已頒布的國家標準、行業標準和地方標準主要是基於常規定性PCR法和實時熒光PCR法對單一動物源性成分的定性檢測。在實際工作中，對於動物源性成分不明確的加工製品，在需明確其成分時，需要通過不同的方法進行多次檢測才能確定結果，其周期長、工作量大、成本高。在未來的動物源成分檢測中，基於常規定性PCR法的檢測技術已經越來越不能滿足多種動物源性製品的鑒定需求，因此建立多重PCR法提高檢測的效率與通量對肉類世界杯賽程預測的及時監管十分重要[1]。本研究通過對新建立的一種檢測動物源性食品中豬、牛、羊、雞和鴨成分的多重PCR法進行混合肉樣檢測，驗證其方法的適用性和可行性，並用建立的多重PCR檢測方法和單一PCR檢測方法對市售的20種動物源性食品分別進行檢測，驗證多重PCR法鑒別豬、牛、羊、雞和鴨成分可行性。

1　材料與方法

1.1　材料及試劑

鮮肉(豬、牛、羊、鴨、雞)購自南京某大型菜市場，-20 ℃保存。加工肉製品(鴨血、牛肉卷、雞肉火腿腸、午餐肉罐頭等)購自南京某菜市場、超市或火鍋食材店。

DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、10×PCR Buffer(Mg2+ plus)、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)、TaKaRa Taq(5 U/µL)、瓊脂糖(50 g)，均購於寶生物工程(大連)有限公司。

1.2　儀器和設備

ABI 2720普通PCR儀，購自美國賽默飛;EPS 300電泳儀，購自Tanon;Universal GenoSens1800凝膠成像儀，購自上海勤翔。

1.3　實驗方法

1.3.1　樣本DNA提取及質量檢測

樣本DNA的提取方法按照DNA提取試劑盒的說明書方法步驟進行。樣本DNA提取後取DNA溶液1 µL，滴加到超微量紫外分光光度計中，測定DNA的質量濃度及純度。DNA濃度控製在50～100 ng/µL，260nm/280nm值為1.8～2.1。

1.3.2　多重PCR方法檢測混合樣品

用所建立的方法對混合肉樣進行PCR擴增，反應時加入2種、3種、4種、5種肉樣的混合模板，按優化的引物濃度配比進行多重PCR檢測，通過多次實驗優化模板混合比例，以達到1個PCR反應和1次電泳可同時擴增出2～5條特異性條帶，達到鑒別2～5種動物源性成分的目的。

1.3.3　市售動物源性食品檢測

對從超市、菜市場和門店隨機購買的20種肉製品，用建立的多重PCR檢測方法和檢測豬、牛、羊、雞和鴨的行業標準[2-4]分別對豬、牛、羊、雞和鴨5種成分進行檢測，以檢驗建立的方法能否成功應用於市售肉類食品中的動物源性成分，進一步驗證此方法的可行性。市售樣品的DNA提取也同樣按1.3.1的方法進行。

2　結果與分析

2.1　DNA質量濃度和純度的檢測結果

按照1.3.1對提取的樣品DNA進行質量濃度及純度測定，結果見表3。

由表1看出，用微量核酸蛋白測定分析儀檢測提取的樣品DNA的濃度和純度，所測260nm/280nm值在1.8～2.1，有的DNA濃度提取的較高，需要對所提DNA的濃度進行適當稀釋，從樣品中提取的DNA無論是濃度還是純度，均能滿足後續PCR擴增實驗的需求。

2.2　混合肉樣品檢測結果

分別以豬、牛、羊、雞和鴨2種、3種、4種及5種肉樣混合為混合模板，用建立的多重PCR檢測方法進行多重PCR檢測。結果見圖1和圖2。

注：M.100 bp DNAladder;1. 豬 + 牛;2. 豬 + 羊;3. 豬 + 雞;4. 豬+ 鴨;5. 牛 + 羊;6. 牛 + 雞;7. 牛 + 鴨;8. 羊 + 雞;9. 羊 + 鴨;10. 鴨+ 雞;11. 豬 + 牛 + 羊;12. 豬 + 牛 + 雞;13. 豬 + 牛 + 鴨;14. 豬 + 羊 +雞;15.豬 +羊 +鴨;16.豬 +雞 +鴨;17.牛 +羊 +雞;18.牛 +羊 +鴨;19. 牛 + 雞 + 鴨;20. 羊 + 雞 + 鴨。

由圖1可以看出，當豬和牛、豬和羊、豬和雞、豬和鴨模板混合比例分別為1︰1、1︰1、1︰2、1︰2時，牛和羊、牛和雞、牛和鴨模板混合比例分別為1︰1、1︰2、1︰2時，羊和雞、羊和鴨、鴨和雞模板混合比例分別為1︰2、1︰2、1︰1時，豬、牛和羊、豬、牛和雞、豬、牛和鴨、豬、羊和雞、豬、羊和鴨、豬、雞和鴨、牛、羊和雞、牛、羊和鴨、牛、雞和鴨、羊、雞和鴨模板混合比例分別為1︰1︰1、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰2︰2時，能分別同時擴增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，雞227 bp，鴨201 bp 2條或3條特異性條帶。

注：M.100 bp DNAladder;1. 豬 + 羊 + 牛 + 雞;2. 豬 + 羊 + 牛 +鴨;3. 豬 + 牛 + 雞 + 鴨;4. 豬 + 羊 + 雞 + 鴨;5. 牛 + 羊 + 雞 + 鴨;6. 豬 + 牛 + 羊 + 雞 + 鴨。

由圖2可以看出，當豬、羊、牛和雞、豬、羊、牛和鴨、豬、牛、雞和鴨、豬、羊、雞和鴨、牛、羊、雞和鴨模板混合比例分別為1︰1︰1︰2、1︰1︰1︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2時，豬、牛、羊、雞和鴨模板混合比例1︰1︰1︰2︰2時，能分別同時擴增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，雞227 bp，鴨201 bp 4條或5條特異性條帶。以上的電泳條帶清晰，亮度基本一樣，能分別有效鑒別出2種、3種、4種或5種動物源性成分。

2.3　市售肉製品檢測結果

對市售的20種肉製品進行DNA提取，應用建立的多重PCR方法和單一PCR分別進行檢測，判斷所檢測成分與所貼標簽是否相符，同時驗證所建立方法的可行性和實用性。擴增結果見表2。

由表2看出，應用建立的五重PCR方法與用單一PCR對市售的20種肉製品分別進行豬、牛、羊、雞和鴨成分進行檢測，由檢測結果對比可以看出，兩種方法檢測出的動物源性成分結果一致。使用混合引物對上述5種成分進行檢測，檢測結果能夠擴增出來相應的多種肉的特異性條帶，該檢測方法能夠準確地鑒定出所建立方法的5種常見動物成分，對於經過加工的肉製品，方法擴增出來的條帶依然很清晰有效。本研究所鑒定的產品大多數與標簽標識成分相符，但也存在造假和摻假的問題，所購買的樣品摻假和造假率為25%。

3　討論

本研究建立的多重PCR法可滿足一次PCR反應和一次電泳就能分別有效鑒別出2種、3種、4種或5種動物源性成分，大大地減少了試劑和時間成本。為驗證所建立方法的可行性和準確性，對市售的20種肉製品應用所建立的五重PCR和單一PCR對樣品分別進行豬、牛、羊、雞和鴨成分的檢測，檢測結果表明所建立的方法與單一PCR檢測結果一致。表明所建立的多重PCR法可同時檢測豬、牛、羊、雞和鴨5種動物源性成分。本研究與王金斌等[1]研究的5種動物源性成分多重PCR檢測方法相比，開發的方法引物數量少3條，與其相比，本研究使用的試劑更少，更加節約時間和成本。

參考文獻

[1]王金斌,白藍,李文,等.同步檢測動物源性成分的五重PCR的條件優化和檢出限分析[J].核農學報,2018,32(3):506-514.

[2]國家食品藥品監督管理總局.SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法[S].北京:中國標準出版社,2008.

[3]國家食品藥品監督管理總局.SN/T 2978—2011動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法[S].北京:中國標準出版社,2012.

[4]國家食品藥品監督管理總局.SN/T 3731.5—2013食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法第5部分:鴨成分檢測PCR法[S].北京:中國標準出版社,2014.

基金項目：江蘇省生產力促進中心青年人才基金項目“食品中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分多重PCR快速檢測方法的建立”(Z2020009)。

作者簡介：馬慧娟(1988—)，女，漢族，河南安陽人，碩士，工程師。研究方向：世界杯賽程預測檢測技術開發。

通信作者：高宏(1976—)，男，漢族，江蘇南京人，碩士，高級工程師。研究方向：食品質量安全檢測技術。