食品中雞源性成分標準檢測方法的比較性研究

2021-02-26 17:04:43來源：世界杯賽程預測導刊

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□ 王瑩尚亞寧鄒寒豔張伶俐（通信作者）重慶市食品藥品檢驗檢測研究院

摘　要：為比較食品中雞源性成分的標準檢測方法，本試驗對3種標準檢驗的引物計、方法及靈敏度進行比較。結果顯示，實時熒光PCR法引物特異性好、方法簡便、靈敏度高。因此得出結論，兩種實時熒光PCR法均可作為雞源性成分檢測的補充方法。
關鍵詞：肉製品實時熒光PCR 雞源性成分
肉類是人體重要的營養來源，與人們的生活息息相關，肉製品的質量安全已成為備受關注的熱門話題。目前，肉製品市場仍然存在“以次充好、摻雜使假”的現象，如不法企業用大量相對廉價的雞肉、鴨肉摻雜少量的牛羊脂肪、骨粉等，然後通過各種深加工手段來冒充牛羊肉以牟取高額利益，這不僅侵害了消費者的權益，更會直接影響消費者的健康。隨著國家世界杯賽程預測監管體係的完善，僅靠感官評價來鑒別肉類真偽的傳統形式已不能滿足對肉製品摻假的監控需求。
為滿足市場監管和消費者的需要，對食品中動物源性成分進行鑒定已成為越來越多研究者關注的熱點[1]。目前，我國建立了一係列基於PCR技術的動物源性成分檢測的國家標準和行業標準[2-3]，但是有關畜禽肉中雞源性成分檢測的研究報道較少[4]。現行的行業標準《動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法》（SN/T 2978-2011）[5]中采用傳統PCR後電泳染色的方法，其靈敏度較低，需要電泳和測序，操作複雜，且電泳所用的核酸染料會對環境造成汙染。因為實時熒光PCR在靈敏度、準確度、便捷性方麵均高於普通PCR，所以本研究主要針對兩種檢測雞源性成分的實時熒光PCR法與現行標準方法進行比較，旨在為後續雞源性成分的檢驗工作提供補充檢驗方法，並為監管部門提供更有力的技術支持。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 材料
新鮮雞肉，購自重慶市本地超市；DNA提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，實時熒光PCR DNA檢測試劑盒：TaKaRa Premix Ex Taq™ （Probe qPCR），瓊脂糖，DNA Marker，均購自TaKaRa公司；2×Power Taq PCR Master Mix，購自百泰克公司。
1.1.2 儀器
Tprofessional PCR儀，德國Biometra公司；Lightcycler 480 II熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；NANO DROP ONE微量核酸分析儀，Thermo公司；Tanon-4500SF凝膠成像係統，上海天能公司。

1.2 實驗方法
1.2.1 DNA提取
將新鮮雞肉攪碎至肉糜狀，參照試劑盒說明書提取DNA，然後用微量核酸分析儀測定濃度，並於-20℃保存備用。
1.2.2 PCR擴增
引物與探針由華大基因合成，方法1為SN/T 2978-2011，方法2為SZDB/Z 267-2017[6]，方法3為SB/T 10923-2012[7]，3種方法的PCR反應體係、擴增程序及引物探針序列信息詳見表1。
1.2.3 3種方法靈敏度的比較
將雞肉的DNA濃度分別稀釋至200、100、10、1ng/μL及100、10、1、0.1pg/μL這8個梯度，並用3種方法進行試驗。

2 結果與討論
2.1 樣品基因組DNA提取
新鮮雞肉未經過深加工，故富含大量且完整的DNA，易於提取。按照試劑盒說明書進行操作，提取雞肉DNA濃度為325.8ng/μL，A260/280為1.89，DNA純度高、質量較好，可以滿足後續PCR檢測需求。

2.2 3種方法的引物比對結果
將3種方法的引物在NCBI進行比對分析，3種引物的模板來源均為雞線粒體，但不位於同一個基因；3種模板序列的同源性為45.48%，參見圖1。

2.3 3種方法PCR擴增結果
2.3.1 普通PCR
按照方法1進行PCR擴增，未能擴增出單一DNA條帶，將引物濃度擴大10倍、100倍和1000倍，結果在將引物濃度擴大1000倍，即引物濃度為10μmol/L時能擴增出陽性條帶。對陽性條帶進行測序，其片段大小正確，且與雞線粒體DNA相對應片段的序列同源性為100%，結果見圖2中A和D。
2.3.2 熒光定量PCR
運用方法2和方法3進行擴增，陰性對照和空白對照均未出現擴增曲線。方法2的陽性對照和樣品有典型的擴增曲線，循環數（Ct值）分別為12.735和16.78；方法3的陽性對照和樣品有典型的擴增曲線，循環數（Ct值）分別為12.225和16.69，檢測結果見圖2中B和C。

圖 2 3 種方法檢驗結果

2.4 3種方法靈敏度的比較
方法1為普通PCR法，在DNA濃度為10ng/μL時可以擴增出陽性條帶，該方法的靈敏度為10ng/μL。方法2和方法3為熒光定量PCR，方法2在DNA濃度為1pg/μL時，Ct值為36.64，當Ct值大於35時，重複實驗有可能會出現陰性結果，故該方法的靈敏度應為10pg/μL；方法3在DNA濃度為0.1pg/μL時，Ct值為36.91，故方法3的靈敏度應為1pg/μL。由此可見，熒光定量PCR的靈敏度遠遠高於普通PCR，結果見圖3。

圖 3 3 對引物模板同源性比較

3 結束語
近年來，以物種DNA為鑒定基礎的PCR技術已經被廣泛用於動物源性成分的鑒別[8-10]，而高質量、高純度及結構完整的基因組DNA是影響PCR擴增的重要因素，故快速、穩定、優質的DNA提取方法將是PCR擴增成功的關鍵。目前，國內外研究發現並使用動物肌肉組織DNA的提取方法有很多，其中較常使用的包括SDS法、異硫氰酸胍法[11]、試劑盒法[12]，以及一些以SDS法為基礎的改良方法[13]。根據劉娜等對於動物肌肉組織DNA提取方法的比較，發現試劑盒法操作簡單、快速、安全，提取DNA的純度、濃度及穩定性均優於其他方法[14]，所獲得的核酸樣本可以在低溫條件下儲存以便複核，且各實驗室間比對差異較小，故本試驗采用試劑盒法提取DNA。
因為線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質，所以本研究中3個標準檢測方法均采用雞線粒體DNA作為靶基因設計特異性引物。線粒體DNA主要以編碼序列構成，基因組序列具有高度物種特異性，種內的異質基因較少[15]，且拷貝數較多，在食品加工過程中未完全降解，而動物組織細胞中均含有大量的線粒體[16]。因此，動物線粒體DNA是一個較為理想的可用於動物源性成分鑒別的良好靶基因[17-19]。
PCR技術的發展為動物源性成分的鑒別提供了有效途徑，實時熒光PCR技術憑借其特異性好、檢測周期短、靈敏度高等優勢，提高了食品中動物源性成分鑒別的準確性，應用前景廣闊。目前，檢測豬、牛、羊、馬、驢等動物源性成分的行業標準均采用實時熒光PCR法。現行檢測雞源性成分的行業標準為普通PCR法，方法中提供的引物濃度不能達到檢測需求。此外，普通PCR還具有較大的局限性，如對檢測樣品的形態要求較高，若樣品為深加工食品或血製品，則其中所含DNA可能無法滿足檢測需求而更易出現假陰性結果[20]，且該方法需要測序，過程較為繁瑣，耗時較長。因此，研究建立快速、高效、準確的雞源性成分的檢測方法尤為重要。本研究通過比較3種標準檢驗方法，結果表明，實時熒光PCR法較普通PCR法更加簡便快速，可以應用於日常食品中雞源性成分的檢測，幫助監管部門提高對肉製品的管控力度，保障人民的世界杯賽程預測，促進肉類產業健康發展。

參考文獻：
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作者簡介：王瑩（1990.10-），女，漢族，籍貫山東，碩士研究生；研究方向：食品藥品檢測；工作單位：重慶市食品藥品檢驗檢測研究院。