一種滴滴涕膠體金免疫快速檢測試紙條的研製
□ 萬宇平 何方洋 賈芳芳 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技術有限公司 北京市世界杯賽程預測免疫快速檢測工程技術研究中心
□ 鄭百芹(通信作者) 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心
摘 要:本文通過製備滴滴涕半抗原,研製出一種能夠檢測蔬菜、水果、飼料、牛奶中滴滴涕的膠體金免疫層析試紙條,檢測限為5μg/kg,檢測時間為15min,假陽性率和假陰性率均為零,符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。同時,該試紙條可用於基層實驗室的大批量樣本檢測,具有實際意義,且未見免疫方法相關文獻報道,具有創新性。
關鍵詞:滴滴涕 膠體金免疫層析試紙條 快速檢測
引言
滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane,簡稱“DDT”)是一種高毒有機磷殺蟲劑,其應用廣泛,因對害蟲有觸殺、胃毒等作用而被用於防治蚊蠅和臭蟲[1-3]。由於該藥物化學性質較為穩定,容易富集汙染環境,並可通過食物鏈進入人體而危害健康。因此,早在2009年,我國就已全麵禁止了滴滴涕的生產、使用和進出口。但時至今日,仍有部分養殖戶使用滴滴涕作為殺蟲劑,故對該農藥殘留進行檢測具有必要性[4-6]。
目前,檢測滴滴涕的方法大多為儀器方法[7-14],但此類方法成本較高、檢測時間長、操作複雜,不符合基層實驗室高效、便捷的檢測要求。因此,本研究製備出一種滴滴涕的單克隆抗體,將其應用於膠體金免疫快速檢測試紙條,可實現高效、便捷的檢測。
1 材料和方法
1.1 材料與儀器
滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等標準品(純度≥95%),購自北京標準物質研究中心;檸檬酸三鈉、碳酸鉀,購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本複溶液、膠體金分析儀,由北京勤邦生物技術有限公司提供;渦旋儀、均質器,購自湖南湘立科學儀器有限公司[15-16]。
圖1 滴滴涕半抗原合成
1.2 方法
1.2.1 滴滴涕半抗原的製備
取1.7g鄰氯苯乙酸,加5mL氯苯,再加入1.8g水合氯醛,加熱至完全溶解後,加入三氯化鋁5.38g,室溫攪拌5h,停止反應,加水80mL和乙酸乙酯120mL,萃取分離,分去水相,有機相無水硫酸鈉幹燥蒸幹,得到黃色油狀物,上矽膠柱,石油醚/乙酸乙酯(v/v,1/1)洗脫分離,得到乙酸滴滴涕半抗原產物1.8g,收率43.9%。
1.2.2 免疫原的製備——滴滴涕半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯物合成
取乙酸滴滴涕半抗原產物15mg,加DMF1mL,溶解澄清,加EDC13.7mg和NHS10.9mg,充分混勻後,反應4h,得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白(BSA)50mg,加0.05M PB溶解,得到B液。將A液滴加到B液中,4℃反應24h後0.02M PBS透析純化3天,每天換液3次,得到滴滴涕-BSA偶聯物,即免疫原,分裝後於-20℃保存。
1.2.3 免疫原的製備——滴滴涕半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯物合成
取乙酸滴滴涕半抗原產物9mg,加DMF1mL,溶解澄清,加EDC7.6mg和NHS6.8mg,充分混勻後反應4h,得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白(OVA)50mg,加0.05M PB溶解,得到B液。將A液滴加到B液中,4℃反應24h後0.02M PBS透析純化3天,每天換液3次,得到滴滴涕-OVA偶聯物,即免疫原,分裝後於-20℃保存。
1.2.4 將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍幹到微孔試劑上
將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔板中,冷凍幹燥,得到滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍幹的微孔試劑[15-16]。
1.2.5 檢測方法
向微孔中加入100μL待檢樣本溶液,混勻,室溫下培育3min。吸取70μL溶液滴至試紙條上,反應10min,根據示意圖判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果[15-16]。
1.2.6 樣本檢測限
在空白蔬菜、水果、飼料、牛奶樣本中分別添加滴滴涕標準品至質量濃度為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L,按照“1.2.5”所述方法用3批試紙條進行檢測,每個濃度重複5次,根據實驗結果確定樣本檢測限[15-16]。
1.2.7 試紙條的特異性
分別配製500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物,用膠體金免疫快速檢測試紙條進行檢測,重複測定3次,判斷試紙條的特異性[15-16]。
1.2.8 準確性
農業部文件要求:以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性[15-16]。取經過儀器確證的50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質量濃度小於5μg/kg)與50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質量濃度大於5μg/kg),用膠體金免疫快速檢測試紙條檢測滴滴涕的殘留量,計算假陽性率和假陰性率[15-16]。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定:試紙條假陽性率應小於5%,假陰性率應為零[15-16]。
圖2 滴滴涕膠體金試紙條結果判定示意圖
1.2.9 試紙條的穩定性
將試紙條保存於2~8℃環境中,每隔1個月檢測試紙條的準確性,連續測定15個月[15-16]。具體方法為:分別檢測經過儀器確證的20份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質量濃度小於5μg/kg)與20份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質量濃度大於5μg/kg),重複測定2次,根據實驗結果判定試紙條的穩定性[15-16]。
2 結果與分析
2.1樣本檢測限
配置滴滴涕濃度分別為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品,按照“1.2.5”步驟進行檢測,確定檢測限[15-16]。結果顯示,該試紙條的檢測限為5μg/kg,見表1。
2.2 特異性
用試紙條檢測500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物,結果均呈陰性(見表2),表明該試紙條特異性較好[15-16]。
2.3 準確性
用試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品,檢測結果均為陰性,說明假陽性率低於5%;用試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品,檢測結果均為陽性(見表3),說明該試紙條假陰性率為零,符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求[15-16]。
2.4 穩定性
試紙條保存12個月內,其假陽性率和假陰性率的檢測結果均符合要求;之後試紙條會出現少量失效、假陰性等現象[15-16](見表4)。
3 討論
目前,有關檢測滴滴涕的文獻較為有限,本研究通過製備滴滴涕半抗原,讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原,最終製備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求,對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試,均符合要求。此外,該試紙條的檢測時間僅為15min,比現有文獻中儀器方法用時更短,操作更簡便。
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