□ 吳廣 賈芳芳 馮才偉 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技術有限公司 北京市世界杯賽程預測免疫快速檢測工程技術研究中心

□ 楊築稀 貴州民族大學社會學與公共管理學院

本文通過製備甲氨基阿維菌素半抗原，研製出一種能夠檢測蔬菜、水果中甲氨基阿維菌素的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為5μg/kg，檢測時間為15min，假陽性率和假陰性率均為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。此外，該試紙條適用於基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義，且未見免疫方法相關文獻報道，故具有創新性。

甲氨基阿維菌素是從發酵產品阿維菌素B1開始合成的一種新型高效半合成抗生素殺蟲劑，溶於丙酮和甲醇、微溶於水、不溶於己烷。因其具有超高效、低毒、低殘留、無公害等生物農藥的特點，故被廣泛應用於蔬菜、果樹、棉花等農作物中以防治多種害蟲。但是，該藥物具有神經毒性和發育毒性，脂溶性強，在動物體內分布廣泛且代謝周期長，容易造成藥物殘留，進而通過食物鏈危害人體健康。因此，對食品中的甲氨基阿維菌素殘留量進行檢測十分必要。

目前，用於檢測甲氨基阿維菌素殘留量的方法大多為儀器方法，但儀器采購成本高、檢測時間長、操作複雜，不符合基層實驗室高效、便捷的檢測要求。因此，本文製備出一種甲氨基阿維菌素的單克隆抗體，並將其應用於膠體金免疫層析試紙條，使其能夠滿足基層實驗室的檢測需求，有利於豐富監管手段和提高監督水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氨基阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素等標準品(純度≥95%)，購自北京標準物質研究中心;氯金酸(HAuCl4·3H2O)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)，購自美國Sigma公司;檸檬酸三鈉、碳酸鉀，購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本複溶液、膠體金分析儀，由北京勤邦生物技術有限公司提供;渦旋儀、均質器，購自湖南湘立科學儀器有限公司。

圖1 甲氨基阿維菌素半抗原合成

1.2 試驗方法

1.2.1 甲氨基阿維菌素半抗原的製備

取0.886g甲氨基阿維菌素，加乙腈70mL溶解，加0.91g氨基丙酸的水溶液2mL，充分攪拌後加入37%甲醛0.32mL與三氯乙酸0.77g，加熱，於60℃反應12h，反應停止後加水80mL與乙酸乙酯100mL，萃取分離，減壓蒸幹，上矽膠柱，石油醚/乙酸乙酯體積比5：1洗脫分離，得到丙酸甲氨基阿維菌素半抗原0.76g，收率為77%。

1.2.2 免疫原的製備——甲氨基阿維菌素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯物合成

取丙酸甲氨基阿維菌素半抗原產物36mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC27mg與NHS19mg，充分混勻後反應4h，得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.05M PB溶解，得到B液;將A液滴加到B液中，於4℃反應24h後0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到甲氨基阿維菌素-BSA偶聯物，即為免疫原，分裝後於-20℃保存。

1.2.3 免疫原的製備——甲氨基阿維菌素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯物合成

取丙酸甲氨基阿維菌素半抗原產物22mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC17mg與NHS13mg，充分混勻後反應4h，得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.05M PB溶解，得到B液;將A液滴加到B液中，於4℃反應24h後0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到甲氨基阿維菌素-OVA偶聯物，即為免疫原，分裝後於-20℃保存。

1.2.4 膠體金的製備

取0.01%氯金酸水溶液100mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊準確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5mL;待氯金酸水溶液變為酒紅色，繼續煮沸15min，冷卻後於4℃避光保存。

1.2.5 甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標記物的製備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至7.2;每毫升膠體金溶液中加入50μg甲氨基阿維菌素單克隆抗體，混勻後靜置10min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min;離心、洗滌、重懸，放置4℃備用。

1.2.6 將甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標記物凍幹到微孔試劑上

將100μL甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標記物加入至微孔試劑微孔板中，置於冷凍幹燥機，冷阱溫度為-50℃，預凍3h，然後真空幹燥15h，即得到甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標記物凍幹的微孔試劑。

1.2.7 檢測方法

向微孔中加入100μL待測樣本溶液，混勻，室溫下孵育3min，吸取70μL滴至試紙條上，反應10min，根據示意圖(如圖2)判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果。需注意，其它時間判讀無效。

圖2 甲氨基阿維菌素膠體金試紙條結果判定示意圖

1.2.8 樣本檢測限

向空白蔬菜、水果樣本中分別添加甲氨基阿維菌素標準品至質量濃度為0、1、3、5、7、9μg/L，按照“1.2.7”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重複5次，根據實驗結果確定樣本檢測限。

1.2.9 試紙條的特異性

分別配製500μg/L的伊維菌素、多拉菌素等藥物，用膠體金免疫層析試紙條檢測，重複3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.10 準確性

農業部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性。取經過儀器確證的50份陰性蔬菜、水果樣品(質量濃度小於5μg/kg)與50份陽性蔬菜、水果樣品(質量濃度大於5μg/kg)，用膠體金免疫層析試紙條進行檢測甲氨基阿維菌素藥物殘留量，計算假陽性率和假陰性率。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定，試紙條假陽性率應小於5%，假陰性率應為零。

1.2.11 試紙條的穩定性

將膠體金免疫層析試紙條保存於2~8℃環境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續測定15個月。具體方法為：分別檢測經過儀器確證的20份陰性蔬菜、水果樣品(質量濃度小於5μg/kg)與20份陽性蔬菜、水果樣品(質量濃度大於5μg/kg)，重複測定2次，根據實驗結果判定試紙條的穩定性。

2 結果與分析

2.1膠體金的鑒定

肉眼觀察製備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質、透明度較高。取冷卻後的膠體金溶液在透射電鏡下觀察其顆粒的均一程度並測量金顆粒粒徑。經透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑約為20nm。

2.2樣本檢測限

配置甲氨基阿維菌素濃度分別為0、1、3、5、7、9μg/L的蔬菜、水果樣品，按照“1.2.7”步驟進行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為5μg/kg，見表1。

2.3特異性

使用膠體金免疫層析試紙條檢測500μg/L的伊維菌素、多拉菌素等藥物，結果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.4準確性

用膠體金免疫層析試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低於5%;用該試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測結果均為陽性，說明該試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。

2.5 穩定性

12個月內，膠體金免疫層析試紙條的假陽性率和假陰性率均符合相關要求。從第13個月起，該試紙條會出現少量失效、假陽性等現象。

3 討論

本研究通過製備甲氨基阿維菌素半抗原，讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原，最終製備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，本研究對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試，結果均符合要求。膠體金免疫層析試紙條的檢測時間僅為15min，比現有文獻中的儀器方法用時更短，操作更簡便。並且，該試紙條檢測限為5μg/kg，靈敏度較高。