□ 李留洋 銳德檢測技術(天津)有限公司

金黃色葡萄球菌是生活中最常見的病原菌之一，也是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重的感染。該菌對營養的要求不高，在普通培養基上生長良好，需氧或兼性厭氧。容易受金黃色葡萄球菌汙染的食品主要為乳製品、蛋及蛋製品、各類熟肉製品，其次是含有乳類的冷凍食品等，因此對於該菌的檢驗也被確定為食品致病性菌種檢驗中的重要項目。

圖 1 樣品處理

按照現行的國標方法，金黃色葡萄球菌檢測方法分為第一法定性檢驗、第二法平板計數法(適用於金黃色葡萄球菌含量較高的食品)，以及第三法MPN計數法(適用於金黃色葡萄球菌含量較低的食品)。

第一法定性檢驗過程包括樣品處理、樣品增菌、平板分離劃線、初步鑒定、確證鑒定這5個步驟，整個流程全部完成至少需要5天時間。第二法平板計數法包括5個步驟——樣品稀釋、樣品接種塗布、典型菌和可疑菌計數、鑒定試驗、結果計算，整個流程全部完成至少需要4天時間。第三法MPN計數法同樣包括5個步驟，即樣品稀釋、樣品增菌、平板分離劃線、鑒定試驗、查MPN表確認結果，整個流程全部完成至少需要5天時間。以下將對金黃色葡萄球菌的檢測流程進行簡單介紹，並對難點、注意事項進行梳理和講解。

1 第一法：金黃色葡萄球菌定性

1.1 樣品處理

固態和半固態樣品：稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯中，充分混勻。

液體樣品：吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。

1.2 樣品增菌

將上述樣品勻液置於36±1℃的恒溫培養箱中培養18~24h。

1.3 平板分離劃線

該步驟是整個金黃色葡萄球菌檢測環節中最重要的步驟之一，因為平板劃線分離的效果決定了可疑菌落的判定和選擇。平板劃線選擇三分法或四分法則分離效果較好，更容易出現單菌落平板。

圖 2 血平板(左)與 BP 平板(右)

1.4 初步鑒定

分離的培養基選用Baird-Parker平板(BP平板)和血平板。結果顯示，金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表麵光滑、凸起、濕潤，菌落直徑為2~3mm，顏色呈灰黑色至黑色、有光澤，常有淺色(非白色)邊緣，周圍繞以不透明圈(沉澱)，其外常有一清晰帶，當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感;有時可見到不分解脂肪的菌株——除沒有不透明圈和清晰帶外，其他外觀基本相同;從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其顏色常較典型菌落略淺，且外觀可能較為粗糙，質地較幹燥。在血平板上，金黃色葡萄球菌形成的菌落較大，呈圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見完全透明的溶血圈。結合兩種培養基的特性即可確定可疑菌落。

1.5 確證鑒定

1.5.1 染色鏡檢

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞和莢膜，直徑約為0.5~1μm。

1.5.2 血漿凝固酶試驗

挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個可疑菌落(小於5個則全選)，分別接種到5mL BHI和營養瓊脂小斜麵，在36±1℃條件下培養18~24h。

購買凍幹兔血漿，按照說明書加入0.5mL無菌生理鹽水溶解，然後加入0.3mL BHI培養物，輕微搖晃至完全溶解或按照說明書直接將0.8mL BHI培養物加入到凍幹兔血漿中輕微搖晃至完全溶解(一般選用後者)，置於恒溫培養箱中，每半小時觀察一次凝集情況，連續觀察6h。根據經驗，若金黃色葡萄球菌呈強陽性，一般1~2h就可凝集，有的甚至長達3h才會凝集。需注意，切忌直接放置6h才進行觀察，因為菌種凝固後會發生自溶現象，隔夜自溶是常見的判斷。凝集的最好方法就是倒立觀察結塊，如倒立後內容物不下落，則效果較好。

1.5.3營養瓊脂純化

典型金黃色葡萄球菌在營養瓊脂上一般呈黃色，較容易判斷;有些呈淡色、白色，但不常見。如果認為鑒定結果可疑，可挑取營養瓊脂小斜麵的菌落到5mL BHI，36±1℃培養18~48h，重複試驗。

圖 3 鏡檢

2 第二法：平板計數法

2.1 樣品稀釋

固態和半固態樣品：稱取25g樣品至225mL稀釋液中(可選用0.85%的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液)充分混勻，即為稀釋度10-1溶液，之後進行梯度稀釋。

液體樣品：吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。

2.2 樣品接種塗布

選擇性平板采用BP平板，該平板可提前一天配製——潔淨台中放置過夜或置於25~50℃培養基中幹燥，直到平板表麵的水珠消失後備用。該步驟的目的是檢查平板是否染菌，最重要的是揮發培養基內部的水分以利於塗布。每個梯度分別吸取1mL樣品勻液，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別接種至3塊BP平板上，然後用無菌塗布棒塗布整個平板。如塗布棒不是一次性的，可以提前滅菌備用，也可用酒精燈灼燒2min以上冷卻備用。塗布時盡量塗幹，注意不要觸及平板邊緣。此後將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱36±1℃培養1h。等樣品勻液吸收後翻轉平板，倒置後於36±1℃培養24~48h(倒置培養的目的在於防止與空氣中的細菌交叉汙染，還可防止培養基水分揮發太快)，觀察結果。

圖 4 典型菌落、陰性及陽性對照凝集效果

2.3 典型菌和可疑菌計數

從圖5可以看出，10-1稀釋度下菌落生長繁多，難以計數;最適計數範圍為20~200CFU，故10-2稀釋度滿足計數要求，可疑菌總數在適宜計數範圍內;而10-3稀釋度下可疑菌落很少，故舍去。從10-2梯度上可以看出，具有沉澱環的菌落很多，這就需要從這些菌種中選擇5個或以上可疑菌落進行血漿凝固酶試驗，但是這5個菌落該如何選擇才能使最終的結果最接近真實值是需要技巧的。

首先可以觀察到，平板上的可疑菌落沉澱環有兩種：一種是和菌落有些距離的沉澱環，記為可疑菌1——經過後期確認試驗可知此菌為幹擾菌，即表皮葡萄球菌;另一種是從菌落邊緣直接延伸出來的沉澱環，記為可疑菌2。將所有可疑菌1與所有可疑菌2的菌落數出來，可判斷出可疑菌落是兩類不同的細菌。根據兩者的比例，決定挑選可疑菌落數的分配情況，比例大的多選，比例小的少選。

圖 5 不同稀釋度條件下的菌落生長狀態

2.4 鑒定試驗

平板法的鑒定試驗過程及注意事項按第一法的“1.4”“1.5”進行。

2.5 結果計算

①若隻有一個稀釋度平板的典型菌落數在20~200CFU之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計算;

②若最低稀釋度平板的典型菌落數小於20CFU，應計數該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計算;

③若某一稀釋度平板的典型菌落數大於200CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計算;

④若某一稀釋度平板的典型菌落數大於200CFU，而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在20~200CFU範圍內，應計數該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計算;

⑤若2個連續稀釋度的平板典型菌落數均在20~200CFU之間，應按式(2)計算。

式(1):

式(1)中，T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數;A為某一稀釋度典型菌落的總數;B為某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數;C為某一稀釋度用於鑒定試驗的菌落數;d為稀釋因子。

式(2):

式(2)中，T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數;A1為第一稀釋度(低稀釋倍數)典型菌落的總數;B1為第一稀釋度(低稀釋倍數)鑒定為陽性的菌落數;C1為第一稀釋度(低稀釋倍數)用於鑒定試驗的菌落數;A2為第二稀釋度(高稀釋倍數)典型菌落的總數;B2為第二稀釋度(高稀釋倍數)鑒定為陽性的菌落數;C2為第二稀釋度(高稀釋倍數)用於鑒定試驗的菌落數;1.1為計算係數;d為稀釋因子(第一稀釋度)。

3 第三法：MPN計數法

3.1 樣品稀釋

按照“2.1”進行。

3.2 樣品增菌

根據對樣品汙染狀況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進行10倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別接種1mL樣品勻液至7.5%氯化鈉肉湯管(如接種量超過1mL，則用雙料7.5%氯化鈉肉湯)。每個稀釋度接種3管，將上述接種物於36℃±1℃培養18~24h。用接種環從培養後的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養物1環，移種於Baird-Parker平板，36±1℃下培養24~48h。

3.3 平板分離劃線

用接種環從培養後的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養物1環，移種於Baird-Parker平板，36±1℃下培養24~48h。

3.4 鑒定試驗

MPN法的鑒定試驗過程及注意事項按第一法的“1.4”“1.5”進行。

3.5 查MPN表確認結果

MPN結果按GB 4789.10-2016中附錄C查詢。

4 總結

以上便是金黃色葡萄球菌檢樣3種方法的簡單操作過程。該菌檢測過程的關鍵步驟是劃線分離和可疑菌落的判定，其中不要放過任何一個可疑菌落;檢測人員進行血漿凝固酶試驗時，需要注意對時間和凝固現象的把控，有些細節的處理還需要大量經驗的積累。