MALDI Biotyper®提高了中國工業微生物菌種保藏中心微生物鑒定的準確性和速度

□ 姚粟 翟磊 中國工業微生物菌種保藏中心

對食品、製藥、化妝品、飼料和環境行業的工業微生物樣品進行專家測試和分析，對於保證合規性、了解製造業所用物質的組成及其完整性至關重要。現如今，由於各實驗室麵臨的壓力越來越大——必須在嚴格的期限內完成任務並達到關鍵績效指標(KPI)，因此兼具高精度與快速獲得鑒定結果能力的分析方法愈發成為優選解決方案。經研究，基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)結合Bruker MALDI Biotyper®(MBT)技術可在眾多工業部門實現樣品鑒定結果的快速獲取，並能夠幫助實驗室完成既定目標。

圖1 CICC使用MALDI Biotyper®進行微生物鑒定

MALDI-TOF MS在行動

中國工業微生物菌種保藏中心(以下簡稱“CICC”)是一家業務繁忙的國家級微生物鑒定與菌株保存中心，為提高用戶響應速度，該中心選擇與Bruker(布魯克)開展合作以獲得支持。

CICC之所以選擇MBT進行快速鑒定，是因為它可以通過擴展本地數據庫來鑒定先前未能明確鑒定的微生物。當前，CICC的菌種庫收集了超過12000個工業微生物菌株及300000個微生物副本，故選擇MBT有助於菌株的快速鑒定。相信未來隨著新菌株鑒定技術的發展，CICC菌種庫的收集數量也將不斷增加。此外，采用MBT能夠顯著提升CICC的工作效率——以往鑒定一個菌株需要24小時甚至更長的時間，而該方法在幾分鍾內即可完成鑒定。MBT的另一項關鍵優勢在於其簡單的工作流程，如圖2。由於MBT對細菌和真菌的分析流程相同，因此無需事先區分細菌和真菌，所有未知樣本放在一起分析即可。

圖2 利用MALDI Biotyper®鑒定未知樣本的工作流程

通常情況下，分析所用的樣本是在選擇性或非選擇性培養基上挑取分離出單菌落的一部分，然後將分離物轉移到一個MALDI靶上，並由基質覆蓋。CICC利用MALDI-TOF質譜原理，結合MBT Compass軟件和參考數據庫，能夠獲得供MBT分析的質譜。該方法通過將生成的質譜與參考數據庫進行比較來鑒定分離物，並可根據顯示匹配提示，在難以區分高度相關物種或僅在屬級進行鑒定的情況下給出明確的結果。同時，CICC還可以此創建自己的參考譜圖來開發自定義數據庫。

在難以對某個菌株進行可靠鑒定時，特別是在菌株來源差異較大的情況下，如來自食品、化妝品或水中的菌株，則可采用結合各種技術和原理的多相方法。當缺少相應的參考譜圖時，某些菌株可能無法通過MBT進行鑒定，因此CICC等實驗室可以依據多相方法來補充或擴展數據庫以提高鑒定結果的準確性。

進一步擴充CICC數據庫

目前，CICC已采用MBT分析了數以百計的菌株，其中，大多數菌株準確鑒定到種水平，評分值高於或等於2.0。但是，當無法通過MBT進行菌株鑒定時，可以選擇生化試驗和16S rRNA基因測序作為菌株鑒定的替代方法。利用該技術，CICC能夠對來自包裝食品、飲料、化妝品及其它消費品等行業的各種菌株進行鑒定。

圖3 用於創建CICC內部數據庫的代表性菌株的質譜圖

一旦通過多相方法進行鑒定，菌株就會被添加到CICC數據庫中以提高未來MBT的鑒定準確率。菌株經TSA平板培養，並根據Bruker樣品製備程序挑選單個菌落製備樣品以創建參考質譜(MSP)並擴充數據庫。表1列舉了經多相方法鑒定並用來擴充CICC數據庫的菌株，相關菌株的質譜圖如圖3所示。

發現新的分離物

當前，MBT已經實現了為CICC提供快速、高準確度鑒定結果的目標。此外，如果數據庫未能包括足夠的生物多樣性以確保鑒定結果的可靠，那麼結合MBT技術與CICC開發的多相方法能通過創建新的MSP並將其添加到數據庫中，從而準確鑒定更多的分離物。同時，擴展後的數據庫可確保以前顯示無可靠鑒定結果的分離物得到可靠的鑒定結果。

2019年4月，最新版本的MBT Compass參考數據庫發布，包含了2969個物種和8468個MPS。其中，增加了一些工業微生物的常見菌種，包括在CICC研究中鑒定出的耐熱細菌(如萎縮芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或腐殖類芽孢杆菌)，以及環境微生物(如海生庫克菌和棲稻假單胞菌等)。接下來，CICC將會繼續與布魯克合作擴充數據庫，並為廣大用戶提供更加快速、準確和可靠的鑒定結果。