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□ 王春霞 山東中儲糧糧油質監中心有限公司

□ 鞏性濤 山東省糧油檢測中心

□ 賀麗麗 拜發分析係統銷售(北京)有限公司

圖1 黃曲黴毒素B1的化學結構式

黃曲黴毒素(AFT)是主要由黃曲黴(Aspergillus flavus)、紅綬曲黴(Aspergillus nomius)和寄生黴菌(Aspergillus parasiticus)所產生的次生代謝產物，包括AFTG2、AFTG1、AFTB2和AFTB1。其中，AFTB1的毒性最大。早在2002年AFTB1就被國際癌症研究機構(International Agency for Research on Cancer)歸類為I類致癌物，其致癌性和致突變毒性對人類健康構成了重大威脅。我國《世界杯賽程預測國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中對食品中AFTB1的最低限量規定為0.5μg/kg，以控製人體對AFTB1的攝入量，從而使其對人體的危害降到最低。

為了滿足現行國家標準對AFTB1限量的規定，以及對AFTB1的毒理學進行風險評估，需要建立一種可靠且準確的檢測方法。其中，儀器分析方法被認為是相對準確的方法，適用於較為複雜的基質分析。由於各種天然基質和加工食品基質的複雜性，以及極低限量的要求，因此需要在儀器分析之前對樣品進行合適的提取、富集與淨化。《世界杯賽程預測國家標準 食品中黃曲黴毒素B族和G族的測定》(GB 5009.22-2016)要求，AFTB1主要通過水和有機試劑(甲醇或者乙腈)的混合液來提取。目前，固相萃取(solid phase extraction，SPE)或免疫親和柱萃取(Immunoaffinity Column，IAC)的方法能夠簡化前處理步驟，提高對AFTB1的選擇性。與傳統的SPE法相比，IAC法能夠獲得更好的回收率及淨化效果。然而，傳統的離線IAC法同樣存在著一些弊端，如耗時長、有機試劑的使用量大、免疫親和柱隻能單次使用、價格成本以及勞動成本較高、不具備可溯源性等。

圖2 RIDA®CREST

本文根據GB 5009.22-2016建立了一種在線免疫親和柱結合RIDA® CREST在線固相萃取的裝置，配合液相色譜熒光檢測器能夠實現對植物油中AFTB1的快速定量方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

高效液相色譜儀和RIDA® CREST在線固相萃取裝置，德國R-Biopharm公司;RF-20A熒光檢測器，日本Shimadzu公司;KOBRA®CELL柱後衍生池，德國R-Biopharm公司。

植物油樣品，山東省糧油檢測中心;AFTB1標準品(25μg/mL)，美國Trilogy公司;黃曲黴總量標準品(5μg/mL)，美國Trilogy公司;SUPELCOSILTM LC-18(150×4.6mm,5μm)，美國Sigma公司;在線AFT免疫親和柱(1×10mm，RBRP900)、離線免疫親和柱(RBRP70N)，德國R-Biopharm公司;甲醇、甲酸和乙腈均為色譜純，購自德國Merck公司;超純水使用美國Millipore公司的Milli-Q水純化係統製備;其它化學試劑均為分析純。

1.2 液相條件

1.2.1在線固相萃取-高效液相色譜法測定條件

色譜條件：色譜柱為SUPELCOSILTM LC-18(150×4.6mm，5μm);流動相A為含120mg/L溴化鉀和350μL 4M硝酸的水/甲醇/乙腈(62/26/12，V/V/V)溶液，B為甲醇/水溶液(90/10，V/V);流速為1.8mL/min;柱溫：27℃;進樣體積：1000μL;熒光檢測器激發波長：360nm，發射波長：430nm。

在線固相萃取條件：

①在線固相萃取柱：IMMUNOPREP® ONLINE AFLATOXIN(Art.No.:RBRPP900);

②活化液：20mM乙酸銨，調節pH至6.80~7.00;

③淋洗液：含20mM乙酸銨和1%Triton X-100(W/V)的水/甲醇/乙腈溶液(90/6/4，V/V/V)，調節pH至8.30~8.50;

④洗脫液：含50mM乙酸銨的水/甲醇/乙腈(62/26/12，V/V/V)，調節pH至1.95~2.05。

1.2.2離線液相條件

色譜條件：

①色譜柱為SUPELCOSILTM LC-18(150×4.6mm，5μm);

②流動相A為含120mg/L溴化鉀和350μL 4M硝酸的水溶液，B為甲醇，等梯度洗脫條件A︰B=60︰40(V/V);

③流速為1.0mL/min;

④柱溫：40℃;

⑤進樣體積：50μL。

圖3 IMMUNOPREP®ONLINE

1.3 植物油樣品預處理

1.3.1在線係統樣品預處理

準確稱取5g樣品至50mL離心管中，加入70%的甲醇水溶液20mL，靜置10min，渦旋5min，6000r/min下離心10min;取上清液用3% Tritox X-100水(W/V)溶液稀釋10倍，取2.0mL以備進樣。

1.3.2 離線免疫親和柱樣品提取及淨化步驟

準確稱取5g樣品至50mL離心管中，加入70%的甲醇水溶液20mL，靜置10min，渦旋5min，6000r/min下離心10min;取上清液4mL，用23mL含有1% Tween-20的PBST進行稀釋，稀釋液全部通過免疫親和柱，自然重力速度滴下。取10mL PBS淋洗免疫親和柱。吹幹免疫親和柱中殘留的液體，用2mL甲醇洗脫，50℃下N2吹至近幹，用流動相複溶，過0.22µm小濾頭，作為樣品備用。

2 結果與討論

2.1 在線固相萃取原理

圖4 在線固相萃取裝置流程圖

在線固相裝置主要包含兩個元件，即自動柱交換裝置(Automated Cartridge Extraction，ACE)和高壓分配器裝置(High Pressure Dipenser，HPD)，具體見圖4。HPD將自動進樣器裝置和ACE裝置連接在一起，能夠對固相萃取所需溶劑的流速和體積進行準確地分配。HPD的主要功能是吸取活化液、淋洗液和洗脫液等。ACE則擁有兩個密接夾，左密接夾可以實現固相萃取中小柱的活化、平衡、上樣和淋洗步驟;待小柱淋洗好之後，小柱被機械臂自動地轉移至右密接夾上，並與液相分析柱聯通;在線免疫親和柱上被捕獲的黃曲黴毒素被洗脫下來，流過液相分析柱，並自動進行數據采集洗脫完畢，使用活化液衝洗小柱以實現其再生。同時，HPD可以對多種溶劑或混合的溶劑進行分配，因此更加有助於對自動化固相萃取方法的開發。整套裝置通過操作軟件Clarity v6.1(DataApex，Czech)進行控製。

2.2 在線固相萃取-高效液相色譜法的線性範圍、檢出限及定量限

取AFTB1原液，用甲醇配置成1ng/mL的標準溶液。適量吸取上述標準溶液，用3% Tritox-100水溶液配製成質量濃度分別為5、10、25、50、100ng/L的係列標準溶液，在“1.2”的條件下，依次進樣1000μL，經兩根在線AFT可重複利用小柱依次固相萃取後進入色譜柱進行分析，以峰麵積為y軸，AFTB1的濃度為x軸，通過Clarity v6.1繪製標準曲線，y=21879.40192x-43.82728，R2=0.9999)，采用外標法定量，標準曲線見圖5。

通過對空白植物油添加低濃度的AFTB1標準溶液，按照在線固相萃取-高效液相色譜法進行預處理，在“1.2”的條件下進樣1000μL進行分析，以性噪比(S/N)為3作為樣品的檢出限(LOD)，以性噪比(S/N)為10作為方法的定量限(LOQ)。最終得出，該方法的LOD和LOQ分別為0.03μg/kg和0.09μg/kg。

圖5 AFTB1標準曲線液相色譜圖

2.3 在線固相萃取-高效液相色譜法的加標回收實驗及精密度

向植物油中添加低、中、高3個水平的AFTB1標準品，每個添加水平平行3次，考察在線固相萃取-高效液相色譜法的回收率及精密度，結果見表3。該結果表明，3個水平的加標回收率在95.13%~101.87%，精密度為1.36%~3.17%。取陽性植物油考核樣進行檢測，結果表示，其平均回收率為98.97%，作日內精密度(n=6),結果顯示日內精密度為1.75%。因此，建立的在線固相萃取-高效液相色譜法具有良好的重現性和穩定性。

2.4 在線免疫親和-液相色譜法和離線免疫親和-液相色譜法檢測植物油中黃曲黴毒素總量的比較

用“1.3.2”與“1.2.2”的離線樣品淨化方法及液相方法對24個植物油樣品中的黃曲黴總量進行檢測，這些樣品同時被在線係統同步檢測，其檢測結果見表5。

如表5所示，上述兩種方法對25個天然樣品的檢測結果基本相符。但也能明顯看出，在線係統整體的檢測值略高於離線方法，其主要有兩大原因：其一是離線人工操作的步驟太多，容易引起誤差;其二是氮吹會引起所提取樣品中黃曲黴毒素的損失，這也說明在線係統的標準化機械化操作不需要氮吹的步驟確實能提高檢測靈敏度。

本實驗一共有25個樣品，從稱樣開始到樣品處理結束後準確上液相進行檢測，離線免疫親和柱需要一位實驗人員不間斷工作10個小時左右。反觀在線檢測，約3個小時就可以得到上機的樣品。得到整個分析結果，離線大約需要20個小時，而在線大約需要12個小時。從實際樣品的檢測效率來看，在線係統大大節省了勞動力，提高了工作效率。

3 結論

本文采用在線AFT免疫親和柱對植物油中的AFTB1進行富集與淨化，結合RIDA® CREST實現固相萃取的全自動化，建立的在線固相萃取-高效液相色譜法隻需進行提取和離心的預處理步驟就可以實現樣品處理。此外，預處理後，一個樣品從上柱到得到分析結果的平均時間大約為15分鍾，平均每天可以處理80個樣品。由此看來，本方法不僅大大縮短了樣品預處理的時間，減少了有毒有機試劑的使用，提升了工作效率，而且在線免疫親和柱可以在線重複多次使用，節約了分析成本，提高了檢測結果的準確性，並具有可溯源性，能夠提高政府檢測單位或第三方檢測機構的公信力。同時，本方法的定量限為0.09μg/kg，滿足世界杯賽程預測 國家標準《食品中真菌毒素限量》(GB 5009.22-2016)對AFTB1檢測方法的檢測限要求，且與現行國標法中的離線免疫親和柱淨化樣品的方法相比較，操作更為簡便，可快速定量檢測植物油中的AFTB1。