氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量
□ 簡德威 熊含鴻 鄭悅珊 洪澤淳 陳科(通訊作者) 廣東省食品檢驗所
摘 要:本文的目的是建立準確、高效的氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法。樣品經正庚烷超聲萃取定容後,采用電子轟擊電離源(EI)、選擇離子監控(SIM)模式進行測定,外標法定量;對前處理中的萃取溶劑、萃取方法、萃取時間進行研究,並對檢測方法進行方法學驗證。根據不同空白基質的加標回收試驗的結果顯示,本方法前處理最優條件為使用正庚烷超聲萃取15min。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在0.1~2.0mg/L濃度範圍內線性良好,相關係數R2=0.997;在不同基質及不同加標濃度下,回收率為82.4%~100.8%,相對標準偏差為1.74%~3.90%。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在不同基質中的檢出限均可達到0.05mg/kg,定量限達到0.15mg/kg。故得出結論,本研究通過對前處理條件的研究和檢測方法的方法學驗證,建立了一種氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法,該方法定性效果好、定量準確,且前處理操作簡便、技術難度較低。
關鍵詞:3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩 氣相色譜-質譜法 食品 超聲萃取
1 引言
3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩(3-acetyl-2,5-dimethylthiophene,ADP)是一種可以作為鹹味香精的食品添加劑,其於2002年開始被用作食品用香料,常用於肉類食品加工中以賦予食品烤堅果味[1]。2013年,歐洲世界杯賽程預測管理局(EFSA)對ADP進行安全評估,發現該物質在體內和體外實驗均表現出基因毒性,會破壞DNA及細胞中的遺傳物質,可能損害人體健康,作為食品用香料使用存在安全隱患[2],長期使用該物質存在世界杯賽程預測問題和隱患,易導致世界杯賽程預測 事件(事故)發生。因此,EFSA將ADP從許可香料中剔除,並嚴禁ADP作為食用香料投放市場或用於食品[3,4]。同年6月14日,歐盟委員會也通過法規Regulation(EC)No 545/2013,禁止將ADP作為食品用香料使用。目前,我國仍允許ADP作為食品用合成香料使用,並收錄於國家標準GB 2760-2014[5]中。但是,中國香精香料化妝品工業協會於2013年8月14日發布自律文件(香化協字[2013]62號),要求香料生產企業不得生產用作食品用香料的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩,食用香精中不得使用該物質[6]。
目前,國內對3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測沒有相應的國家標準。查找相關文獻可發現,對ADP的檢測方法有液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8,9]及氣相色譜三重四級杆質譜法[10]等。液相色譜法的優點是分離效率高、檢測靈敏度高、應用範圍廣,缺點是定性效果差,容易受到雜質、基質等因素的幹擾;氣相色譜-質譜法的優點是前處理簡單、操作方便、定性效果較好,但在複雜的基質樣品中,背景響應較高,致使檢測靈敏度降低;氣相色譜三重四級杆質譜法的優點是定性更準確、抗幹擾能力強、樣品基質背景的響應較低、靈敏度也高於單級質譜,更適用於複雜基質中微量、痕量物質的檢測[11-13],但氣相色譜三重四級杆質譜法操作較複雜,儀器較昂貴,技術難度較高。
考慮到食品基質複雜和檢測技術的難度,采用氣相色譜-質譜法測定3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩可以一定程度地避免受到雜質和基質的幹擾,且定性效果好、定量準確、操作簡便、技術難度較低,因此本研究選擇氣相色譜-質譜法作為檢測方法。
2 材料與方法
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器設備
GCMS-QP2010Ultra氣相色譜-質譜聯用儀[配電子轟擊(EI)電離源],日本島津公司;AB204-S電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;Multifuge X3R離心機,美國賽默飛世爾公司;KQ-500DE超聲清洗器,中國科橋公司;Vortex Genius 3渦旋混合器,德國IKA公司。
2.1.2 材料與試劑
正庚烷(色譜純),康科德科技有限公司;正己烷(色譜純),康科德科技有限公司;乙醇(色譜純),康科德科技有限公司;0.45μm有機濾膜,美國PALL公司;3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準品(純度99%),上海Aladdin公司。
2.2 實驗方法
2.2.1 標準溶液配製
2.2.1.1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準儲備溶液的配製
準確稱取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準品20mg(精確至0.0001g),用正庚烷溶解並定容至10mL,此溶液濃度為2mg/mL。
2.2.1.2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準中間溶液的配製
將3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準儲備溶液(2.2.1.1)用正庚烷稀釋成濃度為20mg/L的標準工作溶液。
2.2.1.3 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準係列工作液的配製
用正庚烷將標準中間溶液(2.2.1.2)稀釋成最終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L的標準係列工作溶液。
2.2.2 前處理方法
稱取1.0g均勻樣品(精確至0.0001g)置於50mL離心管中,加入5mL正庚烷,超聲提取15min,5000r/min離心5min。然後將提取液轉至10mL容量瓶,殘渣用3mL正庚烷重複提取一次,合並所有提取液至10mL容量瓶,用正庚烷定容至10mL,過0.45μm有機濾膜,供氣相色譜-質譜聯用儀分析。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件
CP-wax:50m×0.25mm(內徑)×0.25μm(膜厚)極性毛細管色譜柱;載氣:He,純度99.999%,流速1.5mL/min;進樣口溫度:220℃;進樣方式:不分流進樣;進樣量:1μL;升溫程序:初始溫度50℃保持1min,以20℃/min升溫至200℃保持3 min,再以10℃/min升溫至220℃保持5min。
2.3.2 質譜條件
電子轟擊電離源(EI);電離能量:70eV;接口溫度:225℃;離子源溫度:230℃;溶劑延遲時間:5min;測定方式:選擇離子監控(SIM)。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩參考保留時間及定性、定量離子見表1,3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的質譜圖及色譜圖見圖1、圖2。
圖1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩質譜圖
圖2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩色譜圖
3 結果與分析
3.1 前處理條件的研究
3.1.1 萃取溶劑的研究
日常檢驗檢測中,實驗室大多數使用的低毒萃取溶劑為正己烷、正庚烷、乙醇、異辛烷、二氯甲烷等。本方法選擇常用的正己烷、正庚烷、乙醇作為萃取溶劑,以超聲萃取方式測試不同基質加標樣品的回收率,考察3種溶劑的萃取效率,選擇效率最高的溶劑作為萃取試劑,結果見表2。
從表2的檢驗結果可以看出,使用正庚烷的萃取效率最高,回收率在88.5%~93.5%;其次是乙醇,回收率在79.3%~5.6%;正己烷的回收率最低,隻有58.2%~60.5%。考慮到乙醇和水互溶,而帶入的水分可能會影響質譜性能,因此選擇正庚烷作為萃取溶劑。
3.1.2 萃取方法的研究
常用的萃取方法有超聲萃取、渦旋提取、索氏提取等,本方法采用超聲萃取、渦旋提取,使用正庚烷為萃取試劑,測試不同基質加標樣品的回收率,選取回收率最高的萃取方法作為本方法的最終萃取方法,結果見表3。
從表3的檢測結果可以看出,不同基質通過超聲萃取的回收率在90.8%~95.3%,均高於渦旋提取的回收率(85.2%~89.9%),因此選擇超聲萃取作為本方法的萃取方法。
3.1.3 萃取時間的研究
以正庚烷為萃取試劑,通過超聲萃取法,研究萃取1、5、10、15、20、30分鍾後不同基質加標樣品的回收率,結果見圖3。
圖3 不同萃取時間段樣品的回收率
從圖3可以看出,隨著萃取時間的增加,回收率結果呈現遞增趨勢,但萃取時間超過15分鍾後回收率無明顯變化,考慮到檢測方法的效率,故選取15分鍾作為本方法的萃取時間。
3.2 方法學驗證
3.2.1 標準曲線
通過標準溶液的配製與測定,得出本方法的標準曲線,見圖4。
圖4 標準曲線圖
以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的濃度為橫坐標,峰麵積為縱坐標繪製標準曲線,3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在0.1~2.0mg/L內呈線性關係,線性回歸方程為Y=495019.8X-18840.62,相關係數R2=0.997。
3.2.2 方法檢出限與定量限
方法的檢出限以3倍信噪比(S/N)計算,定量限以3倍檢出限計算。通過測定不同基質的低加標含量,可計算出本方法的檢出限和定量限,結果見表4。
從表4結果可以看出,計算得到不同基質的檢出限分別為0.046、0.048、0.050mg/kg,因此將本方法的檢出限定為0.05mg/kg,定量限為0.15mg/kg。
3.2.3 準確性
通過對不同基質加標量為0.5mg/kg的含量測定,研究本方法的準確性,結果見表5。
從表5可以看出,加標量為0.5mg/kg的固體基質樣品,重複測定6次的平均值為0.47mg/kg,回收率為94.0%;加標量為0.5mg/kg的半固體基質樣品,重複測定6次的平均值為0.47mg/kg,回收率為94.0%;加標量為0.5mg/kg的液體基質樣品,重複測定6次的平均值為0.49mg/kg,回收率為98.0%,均符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控製規範 食品理化檢測》的要求[14],說明本方法可準確定量樣品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量。
3.2.4 重複性
通過對3種不同基質的不同濃度加標含量的測定,計算其回收率和相對標準偏差(RSD),研究本方法的重複性,結果見表6。
從表6的結果中可以看出,固體基質低加標(0.3mg/kg)6次重複測定的回收率在83.6%~89.3%之間,RSD為2.45%;中加標(0.6mg/kg)6次重複測定的回收率在85.2%~91.7%之間,RSD為2.78%;高加標(1.0mg/kg)6次重複測定的回收率在87.1%~93.3%之間,RSD為2.87%。
半固體基質低加標(0.3mg/kg)6次重複測定的回收率在82.4%~90.2%,RSD為3.90%;中加標(0.6mg/kg)6次重複測定的回收率在86.1%~91.3%,RSD為2.20%;高加標(1.0mg/kg)6次重複測定的回收率在90.9%~100.8%,RSD為3.57%。
液體基質低加標(0.3mg/kg)6次重複測定的回收率在86.2%~94.8%之間,RSD為3.46%;中加標(0.6mg/kg)6次重複測定的回收率在86.7%~91.2%之間,RSD為1.74%;高加標(1.0mg/kg)6次重複測定的回收率在92.1%~101.3%之間,RSD為3.23%。
通過不同基質的不同濃度加標回收率及RSD可以看出,本方法滿足GB/T 27404-2008《實驗室質量控製規範 食品理化檢測》的要求[14]。
4 結論
本研究建立了一種氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法。通過對萃取溶劑、萃取方法、萃取時間的研究,確定了較優且操作簡便的前處理條件,並對檢測方法的線性、檢出限、定量限、準確性、重複性進行方法學驗證,確保本方法的結果準確可靠。本研究建立的氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法,定性效果好、定量準確,且前處理操作簡便,技術難度較低,是對目前相對較少的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測方法的補充,為建立3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩檢測的國家標準或方法提供參考依據,同時對執法部門進行食品加工和銷售過程中違規、違法添加化學原料行為的監管提供技術支持,避免世界杯賽程預測 事件發生,從而保障食品行業健康發展和人民舌尖上的安全。
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