MALDI-TOF在食品微生物中的應用：數分鍾內確認和鑒定微生物

作者：Q實驗室首席科學官Erin Crowley

微生物的鑒定和確認涉及許多行業，如製藥、化妝品和食品。準確的微生物檢測有助於製造商快速確定產品質量和安全，例如，檢測可能的食品腐敗生物或食源性病原菌，或監測環境病原菌或生產工程菌菌群。食品行業的監管不斷收緊，不僅監管機構施加壓力，消費者也在施加壓力，要求對食品進行嚴格的檢測。

一係列的微生物都可以汙染食物，包括細菌、酵母菌、黴菌和寄生蟲。常見的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、克羅諾杆菌屬、彎曲杆菌屬，以及單核細胞增生李斯特菌。如果不能盡快檢測出來，它們可以通過受汙染的食物引起嚴重的疾病爆發。通過監測大腸杆菌、李斯特菌、酵母菌和黴菌等質量指標，可對工藝衛生和食品質量進行評價。用於識別食品中的微生物的技術種類繁多，包括傳統的基於培養的方法和使用聚合酶鏈反應(PCR)試驗的分子檢測，以及日益複雜的分析技術，如質譜法(MS)。由於能在屬或種的水平上鑒定微生物，因此篩選得以更為深入的應用。而研究人員和測試製造商則總是在尋找更先進的方法，以便以更高的準確性和靈敏度進行更快速的測試。

質譜的發展

食品工業已經習慣於使用經AOAC或ISO 16140認可的快速檢測方法。這些定性或定量方法已被世界杯賽程預測管理機構接受，而且區域法規也對其應用予以認可，並鼓勵將它們應用於各種各樣的食品。新技術的發展，如基質輔助激光解吸/電離(MALDI)飛行時間(TOF)質譜或測序技術，憑借其更快、更可靠的結果，使食品微生物檢測進入21世紀。

時間往往是對食品微生物實驗室最關鍵的因素，因此MALDI-TOF MS快速、準確地確認與鑒定微生物的能力在常規測試中具有極高價值。對比研究表明，在正確鑒定細菌和真菌方麵，使用MALDI-TOF MS(100%)與使用傳統鑒定板(94-97%)存在差異，MALDI-TOF MS在速度以及試劑成本方麵也擁有的重大優勢[1]。

Q實驗室(俄亥俄州辛辛那提市)的微生物食品實驗室最近采用了MALDI-TOF MS進行日常食品微生物測試以及研發(R&D)工作。微生物鑒定實驗室使用標準的“工具箱”方法，其中包括標準的台式培養方法、自動生化法、鏡檢和16S rDNA測序。對微生物鑒定技術的內部審查，以及客戶對替代方法的要求，推動了對采用MS進行鑒定工作的考慮。當時，實驗室正承接專家鑒定機構外包業務，因此成立了技術進步小組(TAG)，專門負責審查當前使用和未來將要實施的技術。

食品微生物學工作被劃分為兩部分，即常規測試及研發(R&D)，前者由客戶提交樣品以確認並鑒定食品中的微生物);後者則是對客戶希望推廣和銷售的診斷分析方法進行驗證以獲得認證。

MALDI-TOF MS常規測試

2017年1月，微生物食品實驗室將MALDI-TOF MS添加到其用於常規微生物鑒定與研發的工具箱中。該技術可獲得微生物的特征蛋白質指紋圖譜，將指紋圖譜與與覆蓋廣泛的數據庫中數千個參考圖譜相匹配，可以可靠鑒定特定微生物。利用現有技術可對該工具進行補充，例如，使用rDNA測序方法進行基於序列的鑒定。

這種MS技術使實驗室能夠提供靈活的周轉時間(TAT)和成本選項，以適應客戶的需求。這樣就能創建出一種完全定製化的服務，例如根據需要，還有快速菌種鑒定當天出結果的選項，因而極具價值，如果采用以前的方法則無法實現。對MALDI-TOF係統結果的信心以及更高的靈敏度意味著重複測試次數更少，因此在第一次得到鑒定結果時，客戶可以立即做出判定。

在發生病原菌汙染的情況下，以前采用傳統的生化測試方法需要3到7天。假設病原菌檢測結果預判為陽性，那麼確認結果所需的時間十分關鍵，以避免(i)延誤產品召回，並導致可能的感染性微生物的爆發，或(ii)延誤對病原體存在的排除，從而因保質期縮短而導致食品的浪費。食品微生物學實驗室現在用MALDI-TOF MS在30分鍾到2小時內完成樣品分析， 可用於確認某種替代方法的疑似結果，或從平板上直接鑒定微生物。

圖1：從MALDI Biotyper（MBT）獲得的圖譜示例（Bruker Daltonics，Bremen）。

(圖注：Intensity 信號強度;Aspergillus niger 黑曲黴;Bacillus licheniformis 地衣芽孢杆菌;Listeria monocytogenes 單核細胞增生李斯特菌;Salmonella enterica ssp. 腸道沙門氏菌;Yarrowia lipolytica 解脂耶氏酵母)

驗證新的分析方法

常規實驗室測試樣品來自食品，而研發實驗室測試的“樣品”則是技術本身。技術公司以及診斷合作夥伴將新的技術或分析方法帶到Q實驗室進行方法驗證，例如，檢測沙門氏菌、李斯特菌或軍團菌，並要求對其工作提出建議。Q實驗室與客戶和方法驗證組織(如美國的AOAC INTERNATIONAL)製定一種研究設計。研究應滿足AOAC附錄J指南要求[2]。

MicroVal和AFNOR認證是歐洲的認證機構，采用的方法是按ISO 16140標準[3，4]進行評估。“專家實驗室”(在本案例中為Q實驗室)，與技術提供商合作製定方法、並將其提交到認證機構以供技術審核員批準。Q實驗室是北美唯一被三個主要認證機構認可的專家實驗室，即AOAC、MicroVal和AFNOR認證。這使得AOAC/ISO聯合驗證研究的設計、以及滿足所有客戶需求成為可能。

協作研究

在AOAC-OMA研究或ISO 16140驗證研究中，選取一個領先的內部實驗室(如微生物研發實驗室)進行對比協作研究，對技術的重現性進行挑戰。組織實驗室負責在全世界招募12到15個實驗室，同意自願對收到的盲樣進行測試。所有實驗室在同一天使用相同的技術對樣品進行評估。分析完成後，實驗室將數據提交給主導實驗室進行統計分析，然後為客戶生成一份完整報告，並提交給認證機構，由技術委員會進行審查並在協商一致後批準。此批準意味著該方法適用於預定目的並滿足驗證要求。

Q實驗室對Bruker的MALDI Biotyper(MBT)進行了AOAC-OMA和ISO 16140的驗證。通過結合現行指南，如AOAC附錄J指南和新的ISO 16140第6部分標準[4]，創建了一個優化研究設計，以驗證MBT在食品微生物分析中的應用。由於對確認與鑒定方法設計的驗證尚未跟上最新的技術發展，這項研究是同類研究中的第一個。表1給出了提交AOAC-OMA和 ISO 16140批準的MBT合作研究的設計和結果彙總。

Q實驗室作為兩項獨立研究的主導實驗室，2017年12月獲取了MBT的AOAC-OMA研究結果。第一種是確認與鑒定沙門氏菌、克羅諾杆菌和其它革蘭氏陰性細菌(OMA#2017.09);第二種是確認與鑒定食品微生物中的單核細胞增生李斯特菌、李斯特菌屬和其它革蘭氏陽性細菌(OMA#2017.10)[5，6]。Q實驗室也是MicroVal批準的ISO 16140專家實驗室。在2018年初組織了首次研究，並獲得四項證書[7]。2018年4月，在斯德哥爾摩舉行的食品保護內部協會(IAFP)活動上，分別以海報和研討會的形式，與MicroVal技術委員會成員共同發布了該結果[8，9]。

持有AOAC官方分析方法、及ISO驗證/MicroVal認證級別的認證，該方法被食品藥品監督管理局(FDA)接受可用於病原菌確認，並符合歐洲法規EC 2073/2005[10]。FDA和歐洲法規都要求第三方認證機構批準驗證數據，並將其視為與其現有確認/鑒定方法(被視為金標準)具有同等效力的替代方法。

表1：提交AOAC-OMA和ISO 16140批準的

	確認與鑒定準確性
目標分析物	MBT	參考方法*
沙門氏菌屬 非沙門氏菌屬	100% 100%	99.6% 97.5%（87.5%正確種ID）
克羅諾杆菌屬 非克羅諾杆菌屬	100% 99.7%	95.5% 100%（93.8%正確種ID）
李斯特菌屬 非李斯特菌屬	100%（97.8% 正確種ID） 98.9%	100%（86.5%正確種ID） 91.3%
單核細胞增生李斯特菌 非單核細胞增生李斯特菌	99.5% 99.3%（98.9%正確種ID）	87.1% 91.3%

每項研究至少涉及來自7個實驗室的14名合作者。每個合作者至少收到16個目標菌株和8個非目標菌株。

當確認率和鑒定率不同時，括號中顯示的為鑒定率。

*ISO、FDA和USDA參考方法。

微生物確認與鑒定的未來

質譜法一直以來都是一種分析化學工具，最近通過了AOAC-OMA和ISO 16140認證，這證明了在微生物學家掌握下的MBT的可靠性、穩定性和重現性。將MALDI-TOF MS集成到常規測試工作流程中，可實現重大的資源整合，能取代多種傳統的生化鑒定方法，並消除DNA測序中的大量步驟、工作站計量要求帶來的負擔。在分析前無需知道微生物的類型，因為細菌、酵母菌或黴菌都按照相同的工作流程同時進行分析。

由於對食品和環境汙染物的鑒定需求不斷上升，Q實驗室正在擴大其通過MALDI-TOF MS和rDNA測序提供的確認與鑒定服務，並尋求增加其環境測試服務。對於一個分離的菌落，可在15分鍾內獲得確認/鑒定結果，而對於一整塊MALDI 靶板樣品如95個樣品，僅需不到1小時即可獲得結果。當時間對決策者至關重要時，擁有此技術可提高應對能力。

有關Q實驗室的更多信息，請訪問：https://www.qlaboratories.com/

有關Bruker的MALDI Biotyper的更多信息，請訪問：https://www.bruker.com/applications/microbiology/food-beverage.html

關於作者：
Erin Crowley是Q實驗室的首席科學官。她在Q實驗室監督微生物實驗室服務，是AOAC International會員。作為首席科學官，Erin在食品微生物學實驗室的現代化、工作流程精簡以及盡可能提高常規測試效率方麵發揮了不可或缺的作用。

電子郵箱：ecrowley@qlaboratories.com

關於Q實驗室

自1966年以來，Q實驗室一直服務於食品、化妝品、製藥、保健美容和膳食補充劑行業，提供全麵的微生物學、化學實驗室以及研發服務。作為一家將最先進的技術與個人服務和關注相結合的獨立實驗室，Q實驗室可提供滿足所有測試和質量保證需求的服務。Q實驗室通過了ISO/IEC 17025認證，符合GMP/GLP標準，並在FDA注冊，屬MicroVal專家實驗室，AOAC推薦實驗室，AFNOR專家實驗室，通過CDC ELITE水中軍團菌檢測認證，並由俄亥俄州環境保護局認證可進行飲用水微生物分析。實驗室還積極參與AOAC和ISO以及IAFP等專業協會的指南和標準製定。

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