膠體金免疫層析技術快速檢測穀物中的黃曲黴毒素、玉米赤黴烯酮、嘔吐毒素

□賀麗麗 拜發分析係統銷售(北京)有限公司

圖1 RIDA®SMART APP讀數儀

1971年，Faulk和Taylor首次將膠體金引入免疫化學領域，建立了以膠體金標記抗原(或抗體)檢測相應抗體(或抗原)的免疫學新方法。自此，膠體金標記技術成為繼熒光標記、酶標記和放射性免疫標記之後的又一新型免疫標記技術。經過近50年的發展，免疫膠體金標記技術已較為成熟，並被廣泛應用於電鏡水平研究、光顯微細胞化學、免疫沉澱及蛋白質染色技術中。此外，這一技術還被引進免疫診斷/檢測領域，並在醫學檢驗、植物學診斷、刑偵、世界杯賽程預測檢測方麵應用廣泛。德國拜發生產的RIDA®QUICK係列就是利用膠體金免疫層析原理製備成膠體金免疫層析橫流檢測卡，結合德國拜發集團獨有的RIDA®SMART APP讀數儀，能對食品中存在的黴菌毒素進行準確定量檢測。本文通過實驗對德國拜發集團生產的RIDA®QUICK黴菌毒素係列在穀物、花生及花生粗榨油中的檢測應用進行客觀評價。

1 材料與方法

1.1 材料

RIDA®QUICK Aflatoxin RQS、RIDA®QUICK Zearalenon RQS、RIDA®QUICK DON及RIDA®SMART APP讀數儀，均由德國拜發集團提供;用於添加回收實驗的標準品為Trilogy®標準品，用於驗證實驗過程的參考物質為Trilogy®參考物質;用於配合HPLC高效液相色譜使用並進行比對試驗的黴菌毒素免疫親和柱為EASI-EXTRACT® AFLATOXIN、EASI-EXTRACT® ZEARALENONE、DONPREP®。以上所有材料均由德國拜發集團生產，購買自拜發分析係統銷售(北京)有限公司。空白玉米粉基質，來源於國家糧食局科學研究院。

1.2 方法

單克隆抗體膠體金橫流免疫層析法。

1.3 原理

本方法應用膠體金免疫層析原理。樣品提取液中黴菌毒素與檢測卡中報備的膠體金顆粒發生呈色反應，顏色深淺與樣品中黴菌毒素的含量相關，用讀數儀測定檢測卡的顏色深淺，根據檢測卡上檢測帶和質控帶上的顏色飽和度對比，以及與讀數儀內置曲線進行匹配擬合，自動計算出樣品中黴菌毒素的含量。

1.4 樣品處理方法

黃曲黴毒素：取10g代表性樣品，加入70%的甲醇水溶液20mL，渦旋3分鍾，離心或過濾。取上清用試劑盒中的緩衝液2倍稀釋，混勻後作為樣液備用。

玉米赤黴烯酮：取10g代表性樣品，加入70%的甲醇水溶液20mL，渦旋3分鍾，離心或過濾。取上清用試劑盒中的緩衝液6倍稀釋，混勻後作為樣液備用。

嘔吐毒素：取4g代表性樣品，加入60mL試劑盒中的水性提取液，渦旋3分鍾，離心或過濾，取上清作為樣液備用。

1.5 實驗過程

將RIDA®QUICK係列試劑盒回溫至20~23℃，取上層樣液100μL，加入至檢測卡的加樣孔中，用檢測卡自帶的隔溫除濕包裝密閉其反應環境，靜置5分鍾後用RIDA®SMART APP讀數儀進行讀數。

2 結果

2.1 黃曲黴毒素及嘔吐毒素膠體金免疫層析橫流檢測卡的準確度加標實驗及精密度

2.1.1 準確度測定

膠體金免疫層析橫流快速定量檢測卡的準確度依據樣本標定值的檢測偏差來判定，隨機抽取兩個批次定量檢測試劑盒進行檢測，由3位實驗人員分別進行加標，每位實驗人員加標1份樣本，總計3份平行加標樣品，每人每份重複檢測6次，共計54份樣品，計算其平均值。計算方法：(檢測均值-樣本標定值)/樣本標定值×100%。

2.1.2 精密度測定

精密度依據批內精密度和批間精密度兩個方麵來判定，批內精密度指同一批次產品檢測同一樣本結果的重現性，批間精密度指樣本在不同批次產品檢測同一樣本結果的重現性，用變異係數(CV)表示。變異係數(CV)計算方法：變異係數(CV)=標準差/檢測均值×100%。

2.1.3 準確度和精密度

見表1、表2。

2.2 玉米赤黴烯酮膠體金免疫層析橫流檢測卡的準確度加標實驗及精密度

分別測定玉米赤黴烯酮高、中、低(70μg/kg、125μg/kg、250μg/kg)3個濃度標準樣品，每組做7份評價標準樣品。由3位實驗員按照所用產品提供的方法分別獨立提取每組樣品，並按照所用產品提供的方法檢測，計算其標準差(SD)和檢測均值。

2.2.1 準確度測定

準確度依據與標準樣品標定值的檢測偏差來判定，用回收率表示。回收率計算方法：檢測均值/樣本標定值×100%。

2.2.2 精密度測定

精密度依據批內精密度，指同一批次產品檢測同一樣本結果的重現性，用變異係數(CV)表示。變異係數(CV)計算方法：變異係數(CV)=標準差/檢測均值×100%。

2.2.3 結果

見表3。

2.3 有證參考樣及實際樣品中黃曲黴毒素的檢測

將有證參考樣的中值作為參考準確值，樣品既定真實值定值方法如下，黃曲黴毒素：國標GB 5009.22-2016第三法(黃曲黴的柱後衍生選取Kobra cell電化學柱後衍生法);嘔吐毒素：國標GB 5009.111-2016第二法;玉米赤黴烯酮：GB 5009.209-2016第一法。偏離度計算：檢測卡檢測值/既定真實值×100%-100。

黴菌毒素實際樣品檢測卡與樣品既定值的偏離度見圖2、圖3、圖4。

3 討論

通過不同的實驗操作人、不同的實驗樣本及不同試劑盒批次的多次實驗，驗證了黴菌毒素檢測係統的準確度、精密度及對實際樣品檢測的適用性，其回收率基本控製在80%~120%，變異係數小於15%。在實際樣品檢測中，產品檢測值和國標方法檢測值的偏離度控製在±20%範圍之內，這說明，膠體金免疫層析橫向檢測卡準確度與精密度高，適用於實際樣品的檢測。

此類檢測卡的設計原理中溫度、濕度對其檢測的準確度影響極大，如果此方麵的因素沒有控製好，那麼其數值的變化區間可到50%~200%，導致實驗結果不可信。本實驗所用的檢測卡設計精美、製作工藝精良，每個檢測卡自帶流速控製及保溫除濕係統。這樣可以屏蔽實驗環境中的不利因素，在室外、室內，及我國的北方、南方的四季變換都可適用。同時，還避免了檢測時因環境因素而導致的係統實驗偏差，最大限度的發揮了檢測卡的功效。

RIDA®SMART APP讀數儀體積小，內置電源，內存可擴展至256G，可連接網絡，且具備多種加鎖形式。讀數的形式為圖像式，其報告信息包括檢測時檢測卡顯示圖像、實驗人、試驗時間、樣品號碼、樣品檢測值、試劑盒貨號、批號、使用方法等信息，是優良的溯源數據庫。無論在南方、北方的四季變換，還是白天、晚上，隨時隨地都可以準確讀取檢測卡的信息。

綜上所述，該產品針對穀物及食品中的黴菌毒素檢測值準確，整個實驗的精密度好，可以用於穀物及其他樣品中的黴菌毒素含量的現場篩查。

德國拜發集團所產的真菌毒素膠體金定量快檢係統，符合糧油檢測行業係列標準LST 6111-2015、LST 6112-2015、LST 6111-2015的要求。德國拜發集團通過了ISO 13485認證，保證該產品的生產環境與臨床同類產品的生產環境一致;也通過了ISO 9001認證，保證產品批間、批內的穩定性及準確性達到標準要求。CBIFS 2019第十二屆中國國際世界杯賽程預測技術論壇將於4月11~12日在重慶舉辦，拜發將作為本次大會專題讚助商參展並發表主題演講報告。在此，誠邀各位蒞臨拜發的展位(展位號71)參觀指導，交流合作。