乳品中獸藥殘留熒光檢測技術的應用進展
□ 方芳 鄭君傑 孫誌偉 北京市飼料監察所
□ 李蓉蓉 劉薇 楊柳 北京維德維康生物技術有限公司
近年來,乳品質量安全事件頻發嚴重威脅著社會公共健康,故成為國際關注的重點。獸藥殘留是乳品質量管控的重中之重,因為其將直接危害消費者的身體健康。本文介紹了乳品中獸藥殘留的種類和危害,總結了熒光檢測技術在乳品獸藥殘留檢測中的應用,並展望了熒光檢測技術在乳品獸藥殘留檢測領域中的發展前景。
乳及乳製品作為一類營養全麵的理想食品,能夠為人體提供優質的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和無機鹽等基本營養素。此外,乳製品在人類膳食結構中占有十分重要的地位,尤其是嬰幼兒和老人。隨著全球經濟一體化和食品貿易國際化進程的加快,乳品的質量安全已成為世界性的挑戰和全球關注的公共衛生問題。其中,獸藥殘留問題是影響乳製品安全的重要因素之一。目前,乳品中獸藥殘留的主要檢測方法有微生物檢測法、免疫分析法、儀器分析法、適配體傳染器檢測法等。本文就乳品中獸藥殘留的種類和危害進行簡單介紹,並重點總結了熒光免疫分析技術在乳品獸藥殘留檢測中的應用。
1 乳品中獸藥殘留的危害
獸藥殘留是指動物產品中任何可食部分所含獸藥的母體化合物及(或)其代謝物,以及與獸藥有關的雜質。所以,獸藥殘留既包括原藥,也包括藥物在動物體內的代謝產物和獸藥生產中所伴生的雜質。按照用途,可將殘留毒理學意義較大的獸藥分為7類,包括:抗生素類、驅腸蟲藥類、生長促進劑類、抗原蟲藥類、滅錐蟲藥類、鎮靜劑類、β-腎上腺素能受體阻斷劑類,其中抗生素類是最主要的獸藥添加劑,約占藥物添加劑的60%。
人體長期攝入含獸藥殘留的乳品後會造成藥物積累,產生耐藥性和毒害作用,破壞胃腸道菌群環境。乳品中殘留的許多低劑量抗菌藥物如青黴素、四環素類、磺胺類和氨基糖苷類等可使部分人群發生過敏反應,甚至休克;硝基呋喃類、雌激素等都已經被證明具有致癌作用;苯丙咪唑類抗蠕蟲藥具有潛在的致突變性和致畸性;磺胺二甲嘧啶會誘發動物甲狀腺增生,並有致腫瘤傾向。長期食用含以上藥物殘留的乳品後,均可能產生致畸、致癌和致突變等“三致”作用。另外,生長激素、性激素、甲狀腺素類促生長激素以及人工合成的蛋白質同化激素等會幹擾人體內的激素平衡,產生一係列激素樣作用。動物養殖生產中濫用獸藥、藥物添加劑會導致動物的排泄物、動物產品加工的廢棄物汙染生態環境,影響人類健康。因此,乳品中獸藥殘留的快速檢測受到越來越多的重視。
2 熒光免疫分析技術
2.1 原理
1941年,Coons和Kaplan將熒光素和抗體結合來定位組織中的抗原,從而提出了熒光免疫分析法(fluorescent immunoassay, FIA)。該技術用已標記了熒光標記物的熒光抗體(抗原)作為探針,進而檢查組織或細胞內相應的抗原(抗體),並在組織或細胞中所形成的抗原-抗體複合物上沉著有熒光標記物。在熒光顯微鏡下觀察樣品,熒光標記物受激發光的照射而發出熒光,因此可以根據熒光所在的細胞或組織,實現對抗原或抗體的定位,同時還可利用定量技術對樣本進行定量。
2.2 熒光標記物
2.2.1 熒光素
熒光素是指具有熒光特性的有機染料,Coons等首次報道了異氰酸熒光素標記抗體用於檢測鼠組織切片中肺炎球菌抗原分布的研究。此後,Riggs等合成了性質穩定、毒性較低的異硫氰酸熒光素;Marshall等改良了熒光抗體標記技術,使熒光免疫技術得到快速發展。目前,應用於熒光免疫分析的熒光素主要有5種——異硫氰酸熒光素、四乙烯基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、與酶作用後產生熒光的物質和鑭係。
2.2.2 半導體量子點
半導體量子點納米晶,簡稱量子點(quantum dots, QDs),直徑通常在1~20nm之間,一般由II-VI或III-V族元素組成,具有激發譜寬、發射譜窄、熒光性強、不易淬滅、顏色可調等優點,是目前認為最具潛力的熒光探針之一。
2.2.3 稀土離子配合物
稀土離子配合物是指從元素鑭到元素鑥的15種元素的配合物,應用最廣泛的主要是銪(Eu)和鋱(Tb)。以釩酸鹽(YVO4)為基質的納米稀土發光材料是比較具有研究意義及應用價值的稀土熒光材料,由於其固態的微環境,摻雜礬酸鹽的稀土離子配合物可增強其穩定性,避免了溶劑分子對熒光的淬滅,從而可發出高強度的特征熒光。隨著納米科學技術的發展,這一熒光材料有望成為新的免疫熒光標記體。
2.2.4 上轉換納米粒子
Auzel於1966年在研究NaYb(WO4)2鈉玻璃時發現,如基質中含有Yb3+時,Er3+、Tm3+等,在近紅外光激發下可以發射出可見光,由此提出了上轉換發光的概念,即激發光的能量比發射光的能量低,稱之為上轉換發光。上轉換發光大都發生在摻雜稀土離子的化合物中,NaYF4是目前上轉換發光效率最高的基質材料。上轉換納米粒子與熒光染料、量子點相比具有毒性低、靈敏度高、穩定性好的優點,可避免樣品中熒光特性基質對檢測結果的影響,是目前理想的熒光標記物之一。
3 熒光免疫分析技術分類及其在乳品中獸藥殘留檢測中的應用
3.1 熒光偏振免疫分析
熒光偏振免疫分析技術是以免疫競爭原理和熒光偏振原理為基礎的一種快速篩選分析技術,主要用於測定小分子量物質(抗原),即檢測熒光標記抗原在結合特異性抗體前後的熒光偏振值變化,是均相的競爭免疫分析方法。這一反應係統完全在溶液中進行,不需要分離抗體,不易受到溶液顏色、儀器靈敏度的影響,具有操作簡單和檢測時間短等優點,適用於大量樣本的快速篩選。
高月建立了用於檢測牛奶中新黴素殘留的熒光偏振檢測方法,回收率高達87.91%~114.28%。宋佩等以異硫氰酸熒光素(FITC)作為熒光標記物標記沙拉沙星,利用薄層色譜法提純,建立了沙拉沙星的快速熒光偏振免疫分析法。沙拉沙星在緩衝液中的半數抑製濃度(IC50)為43.2mg/L,檢測範圍為5.7~327mg/L,達到了國家規定的動物性食品中獸藥最高殘留限量(80mg/kg)的要求,與環丙沙星、恩諾沙星、加替沙星及氧氟沙星的交叉反應率分別為3.3%、1.8%、1.7%和0.7%,牛奶中沙拉沙星的回收率在71%~94%之間。該方法操作便捷、靈敏度高、特異性強,適用於動物性食品中沙拉沙星殘留的快速篩選檢測。
3.2 時間分辨熒光免疫分析
時間分辨熒光免疫分析采用鑭係稀土元素,如銪(Eu3+)螯合物標記抗原或抗體,螯合物經激發後可發射特征熒光,通過時間延遲和波長分辨進行檢測,使強特異性熒光和背景幹擾熒光區分開,有效地排除了幹擾因素,提高了分析方法的靈敏度。
Leivo等應用TRF結合熒光免疫法對牛奶中的氟喹諾酮進行檢測,其線性範圍為0.2~68.0μg/L,並指出這種檢測方法可以進一步優化以實現各種牛奶樣品中氟喹諾酮的檢測。高文慧等構建了Eu3+-苯甲酸(BA)-鄰菲囉啉(Phen)三元配合物體係熒光探針,檢測牛奶中鹽酸四環素殘留,其線性範圍為1.0×10-6~5.0×10-5mol/L,且具有較好的選擇性和較高的回收率。Bacigalupo等通過建立間接競爭TRFIA對牛奶中的氨苄青黴素進行定量分析,靈敏度明顯高於ELISA,遠超歐盟標準。
3.3 量子點熒光免疫分析
以量子點作為熒光標記探針開發的熒光免疫分析方法,可利用其高強度的熒光信號,大幅度提高獸藥殘留的檢測靈敏度。量子點熒光分析法具有快速、準確、靈敏以及優越的重現性,目前應用和研究愈發廣泛。
李研東等通過製備量子點標記抗體,建立了四環素類藥物殘留量子點熒光免疫分析方法。結果顯示,50%抑製濃度(IC50)為0.9μg/L;四環素、金黴素、土黴素的交叉反應率分別為100.0%、154.0%和46.4%;四環素、金黴素、土黴素的最低檢出限分別為3.0μg/kg、2.0μg/kg和6.0μg/kg,樣本添加回收率在78.7%~97.0%,批內、批間變異係數<15%。國家獸藥安全評價中心於2007年建立了牛奶和豬肉中磺胺二甲嘧啶的直接競爭熒光免疫分析法,其中牛奶50%的抑製率(IC50)為4.3ng/mL,檢測限為0.6ng/mL,此方法的回收率在94.0%~106.2%。Li等通過多殘留熒光微球免疫層分析法對生乳中的紅黴素、螺旋黴素、替米考星和泰樂菌素同時進行檢測,結果顯示,半抑製濃度(IC50)值分別為1.36ng/mL、1.22ng/mL、1.01ng/mL和1.39ng/mL,檢測限(LOD)為0.13ng/mL,回收率範圍分別為91.8%~109.2%、89.6%~114.4%、84.8%~111.6%和85.8%~115.2%。該方法大大簡化了操作步驟,整個測試過程在20min內完成,節省了大量時間。
3.4 上轉換納米粒子熒光免疫分析
HU等人將NaYF4:Yb/Tm上轉換納米粒子標記抗體結合物作為熒光探針,單分散磁性聚苯乙烯微球標記抗原結合物作為免疫信號捕獲探針,用於檢測牛奶樣本中的SQX。標準緩衝液SQX的LOD為0.1μg/L,樣本中為0.5μg/L,標曲線性範圍為0.1~100μg/L。樣本中添加回收率為69.8%~133%,變異率為0.24%~25.06%。該方法無需前處理,可直接稀釋測定,便於現場大批量檢測。
王瑜等以上轉換納米粒子結合己烯雌酚單克隆抗體作為熒光探針,建立了上轉換免疫層析熒光快速定量檢測己烯雌酚殘留方法。該試紙條線性範圍為25~1000ng/mL,檢出限為20.84ng/mL,批內、批間變異係數小於10%,牛奶樣品的添加回收率為90.1%~115.2%,相對標準偏差小於5%,為牛奶中己烯雌酚殘留快速定量檢測提供了新的測定方法。
劉曉等以上轉換發光材料為標記物,建立了可對奶製品中黃曲黴毒素M1進行現場快速檢測的上轉換熒光免疫層析方法。該方法對奶粉和牛奶中黃曲黴毒素M1的檢測靈敏度分別達到0.1ng/mL和0.3ng/mL,每個濃度重複測量的變異係數小於15%。
3.5 熒光猝滅免疫分析
熒光淬滅免疫分析法是指熒光物質分子與溶劑分子或溶質分子之間所發生的導致熒光強度降低的物理或化學作用的過程,與熒光物質分子相互作用引起熒光強度降低的物質稱為熒光猝滅劑。胡高爽等依據熒光共振能量轉移的原理,建立了一種新型免疫標記熒光猝滅試紙條檢測牛奶中獸藥磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline,SQX)的殘留。該免疫熒光猝滅試紙條檢測SQX的方法檢測限為1μg/L,牛奶樣品的檢測限為8μg/L,且該方法操作簡便、靈敏度高、檢測時間短、結果易於判斷,可以用於牛奶中SQX殘留的現場快速檢測。
3.6 熒光免疫層析分析
熒光免疫層析技術是基於抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術,其以固定有檢測線和質控線的條狀纖維層析材料為固定相,測試液為流動相,熒光標記體或抗原固定於連接墊,通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動。該方法具有靈敏度高、穩定性好、受自然熒光本底幹擾低等優點,是快速檢測分析研究的熱點。
Taranova等將具有不同發射波長的量子點偶聯氯黴素抗體、鏈黴素抗體、氧氟沙星抗體為熒光探針,構建了可同時檢測牛奶中3種抗生素的熒光免疫層析試紙條,該試紙條對氧氟沙星的檢測限為0.3ng/mL,氯黴素的檢測限為0.12ng/mL,鏈黴素的檢測限為0.2ng/mL,比使用同一對應抗體建立ELISA方法的檢測限低80~200倍,對實際牛奶樣品的添加回收率為92%~101%。
4 展望
隨著科學技術的日益提高,獸藥殘留檢測技術的水平也在逐步提升。在乳品獸藥殘留的檢測分析中,目前較為常用的儀器分析法、免疫分析法的靈敏度有了顯著提高。相較於儀器分析和常用免疫分析的檢測方法,熒光免疫分析技術由於靈敏度高、特異性強、體積小、操作簡單、成本低等諸多優勢受到科研工作者的廣泛關注,但是也存在一些問題,需要科研工作者逐步進行完善。如開發、探索化學性能好,發光性能優良,在進一步提高檢測結果準確度和靈敏度方麵有極大潛能的新型標記物用於抗原抗體的標記等問題。
相信隨著熒光免疫分析技術的不斷完善,以及自身優勢的凸顯,其在乳品獸藥殘留檢測領域中將得到更廣泛的應用。
基金項目:北京市農業科技示範推廣項目(2018年度)。
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