□ 於家豐 遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心

本文提供了液相色譜-串聯質譜法(LC-MS)檢測飼料原料中維生素A、維生素D3、維生素E的方法，該檢測方法可以實現維生素A、維生素D3、維生素E的聯檢，且LC-MS方法靈敏度較高，比現行高效液相色譜法高1000倍以上。LC-MS方法可應用於飼料原料、糧食、農產品、食品等維生素A、維生素D3、維生素E含量很低的樣品的檢測。該方法在0.1~100IU/L的濃度範圍呈現良好的線性關係，標準曲線R2>0.999;維生素A、維生素D3、維生素E的回收率均達到80.0%~110%，相對偏差不大於15%。

現行的飼料中維生素A、維生素D3、維生素E(以下簡稱“VA、VD3、VE”)的檢測方法均為液相色譜法，其中VA的檢測方法為GB/T 17817-2010，定量限為1000IU/kg;VD3檢測方法為GB/T 17818-2010，定量限為500IU/kg;VE的檢測方法為GB/T 17812-2008，定量限為1IU/kg。飼料原料中VA、VD3、VE含量在方法的定量限之下時，上述方法無法準確檢出它們的含量。雖然飼料原料中VA、VD3、VE的含量很低，但由於飼料原料的添加比例很大，因此飼料中VA、VD3、VE的總量十分很可觀，故研究適用於飼料中VA、VD3、VE低含量的檢測方法是一件十分有價值的工作。

1 研究內容

1.1 優化前處理方法

1.1.1 皂化反應溶液需先離心：皂化反應後的樣液轉移至離心管中，離心取上清液轉移至分液漏鬥中，防止樣品殘渣堵塞分液漏鬥。

1.1.2 用石油醚代替乙醚：石油醚的提取效率和乙醚的提取效率基本相同，且因為石油醚的毒性低於乙醚，因此用石油醚代替乙醚。

1.2 考查線性相關性

用甲醇溶液配置VA、VD3、VE工作液，其係列濃度分別為0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。相同條件下，用串聯質譜檢測上述曲線各點的峰麵積，VA的濃度與峰麵積的相關係數為0.9998，VD3的濃度與峰麵積的相關係數為0.9999，VE的濃度與峰麵積的相關係數為0.9995。

1.3 淨化小柱的選擇

根據VA、VD3、VE的性質特點，應選取吸附特性為非極性的淨化小柱。經查閱資料，選擇安捷倫公司提供的Bond Elut ENN、Bond Elut LMS、Bond Elut ENV、Bond Elut PLEXA 4種淨化小柱。筆者分別考察並進行了VA、VD3、VE過淨化小柱的回收率，其中，Bond Elut PLEXA淨化小柱VA、VD3過柱回收率達到99%，VE過柱回收率達到93%。結果表明，Bond Elut PLEXA小柱可以實現飼料中VA、VD3、VE的淨化。

1.4 洗脫液的選擇

筆者分別考察了乙腈、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正己烷、甲基異丁酮的洗脫效果，回收率表明：用丙酮做洗脫液，VA、VD3過柱回收率達到100%，VE過柱回收率達到98%，因此選擇丙酮做洗脫液。

1.5 淨化程序

用3mL 80%甲醇水溶液活化小柱，適量樣液上柱，再用3mL 80%甲醇水溶液淋洗小柱，抽幹，3mL丙酮洗脫，50℃氮氣吹幹，甲醇溶液複溶，過膜，供LC-MS檢測。

1.6 儀器條件的確定

1.6.1 色譜條件的選擇

本實驗采用實驗室常用的C18色譜柱，以甲醇、水作為流動相進行研究。由於VA、VD3、VE中含有氮原子和氧原子，易於接受氫質子，因此質譜檢測方式選用正離子模式。經實驗比較發現，選用C18色譜柱(柱長100mm，內徑2.1mm，粒徑2.4μm)、0.2%甲酸水溶液和甲醇作為流動相，得到的色譜峰對稱性好，無拖尾現象，待測物與樣品中的雜質分離效果理想。

液相色譜條件為，色譜柱：C18柱、柱長100mm、內徑2.1mm、粒徑2.4μm;流動相：A相為甲醇，B相為0.2%甲酸水溶液,梯度洗脫(見表1);柱溫：40℃;進樣量：10μL。

1.6.2 質譜條件的選擇

由於儀器廠家不同，質譜各參數也不一致，其參考條件如下。離子源：電噴霧離子源;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多反應監測;毛細管電壓、碰撞能量等參數應優化至最佳靈敏度;定性離子對、定量離子對等參數見表2。

1.7 樣品基質效應對回收率的影響

準確移取VA、VD3、VE標準溶液適量，分別加入6份空白樣品中。經提取、淨化及濃縮後，加甲醇溶液定容，充分混勻，製得濃度為0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L的基質匹配標準工作液，現用現配。

1.8 飼料原料加標回收試驗

選擇典型的飼料原料，包括玉米麵、米糠、小麥麩、棉粕，回收結果為80%～110%。回收試驗表明，該方法定量檢測對飼料原料均有較好的適用性(見表3)。

1.9 部分飼料原料檢測結果

對米麵、米糠、小麥麩、棉粕4種植物性飼料原料進行了檢測。4種植物性飼料原料中維生素E的含量較高，其中，米糠的含量最高，達到了39.88IU/kg;小麥粉次之，達到了20.25IU/kg;棉粕的含量最低，為3.354IU/kg。4種植物性的飼料原料中VA、VD3均未檢出，檢測結果見表4。

1.10 檢出限與定量限

空白飼料中VA、VD3、VE添加濃度為0.5IU/kg,信噪比>10，因此定量限確定為0.5IU/kg。空白飼料中VA、VD3、VE添加濃度為0.1IU/kg，信噪比>3，因此檢出限確定為0.1IU/kg。

2 討論

2.1 飼料原料中維生素E的含量不能被忽略

農業部2625號公告給出配合飼料中VE推薦添加量。由表4可知，如果配合飼料中添加一定比例的米糠、小麥粉等飼料原料，飼料配方設計中外源性VE添加量為飼料配方設計的VE理論添加量減去飼料原料中VE含量，且外源性VE的添加量會一定程度地減少。在飼料生產實踐過程中節約了VE的添加成本，提高了飼料加工生產效益。

2.2 皂化過程對VA、VD3、VE有一定的破壞作用，因此，要用經過皂化反應的VA、VD3、VE的對照品來定量。

2.3要注意基質效應，飼料原料中VA、VD3、VE的檢測是有一定的基質效應的，因此要充分考慮樣品的基質效應，飼料原料基質效應見表6。

3 研究結果

維生素A的濃度與峰麵積的相關係數為0.9998，維生素D3的濃度與峰麵積的相關係數為0.9999，維生素E的濃度與峰麵積的相關係數為0.9995。方法定量限為0.5IU/kg，方法檢出限為0.1IU/kg。相對偏差小於20%。回收率在80%～110%。回收試驗表明，該方法適合飼料原料中維生素A、維生素D3、維生素E的檢測。