辣椒製品中蘇丹紅Ⅰ的快速檢測

　　膠體金免疫層析法(KJ201801)

　　1　範圍

　　本方法規定了辣椒製品中蘇丹紅I的膠體金免疫層析快速檢測方法。

　　本方法適用於辣椒醬、辣椒油、辣椒粉等辣椒製品中蘇丹紅I的快速測定。

　　2　原理

　　本方法采用競爭抑製免疫層析原理。樣品中的蘇丹紅I與膠體金標記的特異性抗體結合，抑製了抗體和檢測線(T線)上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控製線(C線)顏色深淺比較，對樣品中蘇丹紅I進行定性判定。

　　3　試劑和材料

　　除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的二級水。

　　3.1　試劑

　　3.1.1　乙腈。

　　3.1.2　無水硫酸鎂。

　　3.1.3　正己烷。

　　3.1.4　二氯甲烷。

　　3.1.5　氫氧化鈉。

　　3.1.6　氫氧化鈉溶液(2mol/L)：稱取氫氧化鈉(3.1.5)8g，用水溶解並稀釋至100mL。

　　3.1.7　無水乙醇。

　　3.1.8　複溶液：將無水乙醇(3.1.7)與水按照體積比25:75混勻。

　　3.2　參考物質

　　3.2.1　蘇丹紅I參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥95%。

　　表1 蘇丹紅I參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量

中文名稱	英文名稱	CAS登錄號	分子式	相對分子量
蘇丹紅I	Sudan I	842-07-9	C16H12N2O	248.28

　　3.3　標準溶液的配製

　　3.3.1　蘇丹紅I標準儲備液(1mg/mL)：精密稱取蘇丹紅I標準品(3.2.1)適量，置於10mL容量瓶中，加入適量乙腈(3.1.1)超聲溶解後，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，製成濃度為1mg/mL的蘇丹紅Ⅰ標準儲備液。﹣20 ℃避光保存，有效期6個月。

　　3.3.2　蘇丹紅I標準中間液(1μg/mL)：精密量取蘇丹紅I標準儲備液(1mg/mL)(3.3.1)100μL，置於100mL容量瓶中，用乙腈(3.1.1)稀釋至刻度，搖勻，製成濃度為1μg/mL的蘇丹紅I標準中間液。

　　3.4　材料

　　3.4.1　固相萃取柱：CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱(200mg/3mL)，或相當者。

　　3.4.2　蘇丹紅I膠體金免疫層析試劑盒，適用基質為辣椒醬、辣椒油、辣椒粉。

　　3.4.2.1　金標微孔。

　　3.4.2.2　試紙條或檢測卡。

　　4　儀器和設備

　　4.1　移液器：200μL、1mL和5mL。

　　4.2　渦旋混合器。

　　4.3　離心機：轉速≥4000r/min。

　　4.4　電子天平：感量為0.01g。

　　4.5　氮吹儀。

　　4.6　水浴鍋。

　　4.7　環境條件：溫度15℃～35℃，濕度≤80%。

　　5　分析步驟

　　5.1　試樣製備

　　取適量樣品，液體樣品或半固體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。

　　5.2　試樣的提取

　　5.2.1 辣椒醬

　　稱取辣椒醬2g(精確至0.01g)於15mL離心管中，加入0.5g無水硫酸鎂(3.1.2)和5mL正己烷(3.1.3)提取液，渦旋振蕩1min後，4000r/min離心5min。將上清液全部加入到固相萃取柱(3.4.1)中，流出液棄去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液棄去。用2mL二氯甲烷(3.1.4)洗脫固相萃取柱，收集洗脫液吹幹。精密加入400μL複溶液(3.1.8)，渦旋混合1min，作為待測液，立即測定。

　　5.2.2 辣椒油

　　稱取辣椒油5g(精確至0.01g)於15mL離心管中，加入8mL正己烷(3.1.3)進行提取，渦旋振蕩1min後，將上清液全部加入到固相萃取柱中，流出液棄去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液棄去。用2mL二氯甲烷(3.1.4)洗脫固相萃取柱，收集洗脫液吹幹。精密加入400μL複溶液(3.1.8)，渦旋混合1min，作為待測液，立即測定。

　　5.2.3 辣椒粉

　　稱取辣椒粉3g(精確至0.01g)於50mL離心管中，加入8mL乙腈(3.1.1)提取，渦旋振蕩1min後，6000r/min離心5min。轉移上清液於10mL離心管中，吹幹後加入2mL氫氧化鈉溶液(3.1.6)，渦旋混勻30s後置於80℃水浴皂化5min。再加入2mL正己烷(3.1.3)，渦旋萃取30s後，6000r/min離心5min，轉移上清液於新的10mL離心管中，加入無水硫酸鎂(3.1.2)0.5g，渦旋振蕩30s後，4000r/min離心5min，轉移上清液於10mL離心管中吹幹。精密加入400μL複溶液(3.1.8)，渦旋混合1min，作為待測液，立即測定。

　　5.3　測定步驟

　　5.3.1 試紙條與金標微孔測定步驟

　　吸取200μL待測液於金標微孔(3.4.2.1)中，抽吸5～10次使混合均勻，室溫溫育3～5min，將試紙條(3.4.2.2)吸水海綿端垂直向下插入金標微孔中，溫育5～8min，從微孔中取出試紙條，進行結果判定。

　　5.3.2 檢測卡與金標微孔測定步驟

　　吸取200μL待測液於金標微孔(3.4.2.1)中，抽吸5～10次使混合均勻，室溫溫育3～5min，將金標微孔中全部溶液滴加到檢測卡(3.4.2.2)上的加樣孔中，溫育5～8min，進行結果判定。

　　5.4　質控試驗

　　每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。

　　5.4.1　空白試驗

　　稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

　　5.4.2　加標質控試驗

　　準確稱取空白試樣(精確至0.01g)置於具塞離心管中，加入一定體積的蘇丹紅I標準中間液(3.3.2)，使蘇丹紅I添加濃度為10μg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

　　6　結果判定

　　通過對比控製線(C線)和檢測線(T線)的顏色深淺進行結果判定。目視判定示意圖見圖1。

　　6.1　無效

　　控製線(C線)不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

　　6.2　陰性結果

　　檢測線(T線)顏色比控製線(C線)顏色深或者檢測線(T線)顏色與控製線(C線)顏色相當，表明樣品中蘇丹紅I低於方法檢測限，判定為陰性。

　　6.3　陽性結果

　　檢測線(T線)不顯色或檢測線(T線)顏色比控製線(C線)顏色淺，表明樣品中蘇丹紅I的含量高於方法檢測限，判定為陽性。

　　6.4　質控試驗要求

　　空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。

　　a) 試紙條

　　b) 檢測卡

　　圖1 目視判定示意圖

　　7　結論

　　當檢測結果為陽性時，應對結果進行確證。

　　8　性能指標

　　8.1　檢測限：10μg/kg。

　　8.2　靈敏度：靈敏度應≥99%

　　8.3　特異性：特異性應≥85%。

　　8.4　假陰性率：假陰性率應≤1%。

　　8.5　假陽性率：假陽性率應≤15%。

　　注：性能指標計算方法見附錄A。

　　9　其他

　　本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規定的各項性能指標。

　　本方法參比標準為GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法高效液相色譜法》。

　　附錄A

　　定性方法性能計算表

　　表A.1 性能指標計算方法

樣品情況a	檢測結果b		總數
	陽性	陰性
陽性	N11	N12	N1.=N11+N12
陰性	N21	N22	N2.=N21+N22
總數	N.1=N11+N12	N.2=N21+N22	N=N1.+N2.或N.1+N.2
顯著性差異(х2)	c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1
靈敏度（p+，%）	p+=N11/N1.
特異性（p-，%）	p-=N22/N2.
假陰性率（pf-，%）	pf-=N12/N1.=100-靈敏度
假陽性率（pf+，%）	pf+=N21/N2.=100-特異性
相對準確度，%c	（N11+N22）/(N1.+N2.)
注： a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果； b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認後的結果。 N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。