《世界杯賽程預測 導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

登陸 | 注冊 | 設為首頁 | 加入收藏

豬組織中賽庚啶間接競爭ELISA檢測方法研究

2017-12-06 16:02:19來源:

評論0我來說兩句
□ 楊玉婷 佟世生 北京城市學院生物醫藥學部
□ 秦譽 北京維德維康生物技術有限公司
酶聯免疫分析方法(Enzyme-Linked Immuno-So rbent Assay, ELISA)具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點,適用於現場監控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期製備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎上,建立了對豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法,為後續檢測產品研發奠定了基礎。

賽庚啶(Cyproheptadine,CLD)是一種具有抗膽堿能力和鎮靜作用,可用於治療各種過敏性疾病的抗組胺藥,也可用於改善患者食欲。近年來,人們發現在飼料產品中添加賽庚啶會增加動物食欲,可達到增加養殖動物體重的目的。但食用含賽庚啶殘留的動物源性產品會對人體造成不利影響,濃度高時可直接引發昏厥、呼吸急促、全身無力等中毒症狀,嚴重者則直接導致死亡。
農業部1519號公告將賽庚啶列入《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》,然而飼料安全預警監測結果表明,國內仍然有一些飼料產品中添加了此類藥物,同時也有在豬肉組織中檢出賽庚啶殘留的報道。因此,加強對賽庚啶殘留的檢測迫在眉睫。目前,已報道的檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法,而且多為動物尿液及飼料中賽庚啶殘留的檢測。因此,建立一種直接、方便、靈敏、高效、準確的檢測方法十分必要。酶聯免疫分析方法具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點,適用於現場監控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期製備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎上,建立了對豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法,為後續檢測產品研發奠定了基礎。
材料與方法
材料與試劑
賽庚啶和可樂定標準品(98%中國獸醫藥品監察所)、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(美國Jackson)、四甲基聯苯胺(華美生物工程公司)、小牛血清(杭州四季青)、牛血清白蛋白(美國SIGMA)、賽庚啶完全抗原和單克隆抗體(北京維德維康生物技術有限公司研發中心製備保存);豬肉、豬肝等樣本(超市)。甲醇、二氯甲烷、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純級別(國藥集團)。
儀器與設備
MK-3酶聯免疫測定儀(Thermo);QL-901渦動儀(海門其林貝爾);TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠);酶標板(廈門雲鵬);氮吹儀(美國organomation);移液器(Thermo);精密電子天平(梅特勒-托利多)。
方法
1 ELISA檢測條件的優化
1.1 最適包被濃度與最適單抗濃度的優化
將包被抗原以1:2000、1:10000、1:50000、1:250000稀釋包板,每個稀釋度包兩條作為平行。比較各組的最大吸光度和抑製率,確定最適包被濃度。
單抗設定1:2000、1:10000、1:50000、1:250000共4組稀釋度。比較各組最大吸光度和抑製率,確定最適單抗稀釋倍數。
1.2 包被液pH的優化
分別用3種不同pH值的包被液將賽庚啶包被原稀釋至最適工作濃度。比較各組最大吸光值、靈敏度點抑製、IC 50值和曲線的線性,確定最適包被液pH。
1.3 封閉液的優化
分別用4種不同配方的封閉液封閉,37℃溫育2h,其餘變量相同。比較各組最大吸光值、靈敏度點抑製、IC 50值和曲線的線性,確定最適封閉液配方。
1.4 包被條件的優化
用包被液將賽庚啶抗原稀釋至最適工作濃度,每孔100μL,分成3組。第一組:37℃溫育2h;第二組:室溫放置2h;第三組:4℃過夜。比較各組最大吸光值、靈敏度點抑製、IC 50值和曲線的線性,確定最適包被條件。
1.5 樣品溶液與單抗溶液體積比例的優化
加入樣品溶液和單抗溶液比例分別為:30μL:70μL、40μL:60μL、50μL:50μL、60μL:40μL、70μL:30μL和80μL:20μL。比較最大吸光度和抑製率,確定最適樣品與單抗體積比例。
1.6 試劑盒特異性的確定
選擇對賽庚啶類似物可樂定(Apraclonidine)、羅米非啶(Romifidine)、替紮尼定(Tizanidine)、賽拉嗪(Xylazine)、克倫特羅(Clenbuterol)、萊克多巴胺(Ractopamine)和沙丁胺醇(Salbutamol)進行測定,得到各類似物在標準曲線各點的OD值,應用RIDAWIN軟件分析,得出類似物的IC 50,從而計算其交叉反應率(CR):
交叉反應率(CR)=IC 50(CLD)/IC 50(類似物)×100%
1.7 試劑盒精密度的測定
用零標準的OD值來測定ELISA方法的可重複性,分別測定板內差、批內差和批間差。
2 樣本的添加回收試驗
樣本的前處理方法如下:
豬肉:準確稱取2±0.01g均質後的新鮮組織樣品於50mL離心管中;加入1mL 0.1M鹽酸,再加入1mL無水甲醇,室溫(25±2℃)下,充分渦動3min;4000r以上,離心10min;取100μL上清液於新的離心管中,再加入400μL 0.02M PBS,渦動30s混勻,然後進行檢測。
豬肝:準確稱取2±0.01g均質後的新鮮組織樣品於50mL離心管中;加入0.5mL 0.1M鹽酸,再加入0.5mL 1M EDTA-2Na溶液,最後加入1mL無水甲醇,室溫(25±2℃)下,充分渦動3min;4000r以上,離心10min;取100μL上清液於新的離心管中,再加入400μL 0.02M PBS,渦動30s混勻,然後進行檢測。
每個添加濃度做兩份樣品,每份樣品的提取液做兩個重複。各樣品經上述方法處理後,用優化的ELISA方法檢測,測定OD450值,用RIDAWIN軟件分析數據,得出賽庚啶的含量,並根據下式計算添加回收率。
添加回收率(%)=實測值(ng/mL)/添加值(ng/mL)×100%
結果與分析
ELISA檢測條件的優化
1 最適包被濃度與最適單抗的優化
\
實驗選擇最大吸光值在2.0左右,靈敏度抑製率在80%以下為合適的抗原抗體稀釋倍數。最適包被濃度與最適單抗的優化結果見表1、表2,由表可知,隨著包被原濃度和抗體濃度的降低,最大吸光值也在降低,當抗原做1:50000稀釋,抗體做1:10000稀釋時,靈敏點抑製率為79.3%,最大吸光值和靈敏度抑製均符合要求,故確定其為最適稀釋度。
2 包被液的優化
\
結果見表3,由表3可知,比較3種緩衝液的最大吸光值、靈敏度點的抑製率、IC 50及曲線線性,選擇0.05mol/L、pH=9.6的碳酸鹽緩衝液做為包被液。
3 封閉液的確定
分析較幾種常用的封閉液,結果見表4。選擇最大吸光值較大,IC 50較低,曲線線性大於99%,靈敏度點抑製在70%~80%之間的封閉液,最終選擇5%的脫脂奶粉做為封閉液。
\
4 包被條件的優化分析
包被條件的優化見表5,實驗選擇最大吸光值較大,靈敏度抑製率為70%~80%,IC 50在0.1ng/mL左右,線性相關係數在99%以上的數據,由表確定4℃反應16h作為試劑盒的最佳包被條件。
5 樣品溶液與單抗溶液體積比例的確定
\
結果見表6,樣品溶液與單抗溶液體積比為40:60時,靈敏度抑製率在70%~80%之間,最大吸光度值在2.0左右,線性相關係數為99.45%,因此確定樣品溶液與單抗溶液體積比為40:60。
\
6 特異性的測定
結果見表7,該單抗與賽庚啶、可樂定、羅米非啶、替紮尼定、賽拉嗪、克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的交叉反應率分別為100.0%、0.1%、0.05%,其餘均小於0.05%,表明對賽庚啶靈敏。
\
7 精密度的測定
精密度通常用標準樣品的批內和批間相對標準差(RSD)或者變異係數(CV)來進行考察,一般要求CV應小於10%。精密度的測定見表8,由表8可以看出3批酶標板的板內變異係數小於5%,板間變異係數小於10%,符合要求。
樣本的添加回收率檢測
\
取空白樣本各5份,根據檢測限要求對樣品進行添加,每種樣本、每個濃度各做2個平行,按提取方法進行提取稀釋,所得樣本溶液進行ELISA檢測,計算添加回收率。表9、表10表明兩種組織的添加回收率均在70%~128%之間。
結語
本研究在已製備的賽庚啶抗原和單克隆抗體的基礎上,對抗原濃度、抗體濃度、包被液配方、封閉液配方、包被條件等進行了摸索和優化,研製了檢測豬肉組織中賽庚啶的ELISA方法,該方法IC 50變動範圍在0.1~0.15ng/mL之間,豬組織中檢測限為0.5μg/kg,添加回收率70.0%~128.0%之間(添加濃度為0.5μg/kg和1.0μg/kg),樣本重複檢測的變異係數在2.6%~12.1%之間,具有良好的特異性、準確性和重複性,表明本ELISA方法的穩定性符合檢測要求,能夠滿足對豬組織賽庚啶檢測的需要。
微信關注

相關熱詞搜索:中賽方法研究

[責任編輯:]

相關閱讀

    食安中國 Copyright © www.cnfoodsafety.com 2012-2018

    京ICP備09075303號-1 海澱分局網絡備案編號:1101085079,1101055372

    地址:北京市海澱區西四環中路39號萬地名苑1號樓1004室(郵編100039)

    聯係電話:010-88825653 010-88825683 010-64972251 010-88825687 業務谘詢:010-88825689 值班電話:18600563206