擬除蟲菊酯是一類人工合成的殺蟲劑，包括醚菊酯、苄氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯等20種農藥，因其殺蟲譜廣且效果好而被廣泛用於防治農業害蟲，在蔬菜、果樹害蟲防治等方麵取得了較好的效果。目前，擬除蟲菊酯類農藥已成為我國使用量最大的農藥種類之一，但是由於使用麵積大、應用範圍廣、接觸人群多、生物毒性強、高殘留且具有富集性及難以降解等特殊性質，擬除蟲菊酯農藥殘留也已成為一種嚴重的環境汙染問題，因其導致的中毒現象屢有發生，尤其是穀物、水果、蔬菜等食品中殘留的低濃度農藥進入人體所造成的慢性和亞慢性毒性問題。我國強製性國家標準GB 2763-2016《 世界杯賽程預測國家標準食品中農藥最大殘留限量》中明確規定了擬除蟲菊酯類各種農藥的殘留限量要求，其中蔬菜中的MRL低至0.5mg/kg；歐盟也將擬除蟲菊酯類農藥定為農產品中不得檢出的農藥品種。隨著我國國際化進程的不斷加快，國內的檢測標準和方法靈敏度呈現出越來越嚴格的趨勢，這意味著對國內檢測方法的技術水平和便捷性提出了更高的要求。
目前，對擬除蟲菊酯殘留的檢測主要為儀器檢測法，包括氣相色譜-電子捕獲法（Gas Chromatography- Electron Capture DetectorGas，GC-ECD）、氣相色譜-質譜法（Gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）等。盡管這些方法靈敏度較高，但樣品的前處理步驟較多，相對費時且檢測費用較高，不適用於大量樣品的檢測。
酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種基於抗原抗體反應和酶化學反應的檢測方法，具有特異性強、樣品容量大、樣品前處理簡單和分析成本低等特點，在大量樣本和現場樣本快速篩選檢測中顯現出明顯優勢。目前已有學者初步研究了ELISA技術用於擬除蟲菊酯類藥物檢測，文孟棠等人研究了大白菜中擬除蟲菊酯類農藥半定量ELISA檢測方法，優化了抗原抗體反應時間，但是對63個大白菜樣本檢測假陽性率達9.3%，假陰性率達2.7%，樣本少且誤判率較高，不利於實際應用；駱愛蘭、餘向陽等人研究了甲氰菊酷、氯氰菊醋、三氟氯氰菊酷、澳氰菊醋4種農藥的ELISA同時檢測，但是檢出限僅能達到217.2μg/kg，且假陽性率為4.72%，檢測水平有待提高；郝曉蕾利用間接ELISA方法研究了氰基擬除蟲菊酯的快速檢測，但是靈敏度不高，檢測指標有限。由此看來，目前關於酶聯免疫吸附法用於擬除蟲菊酯類藥物檢測的文獻報道較為匱乏，多種農藥殘留同時檢測技術、相關產品研製與應用均存在巨大潛力。
本研究通過自主研發人工抗原及多克隆抗體，建立了蔬菜中擬除蟲菊酯類農藥殘留ELISA快速檢測方法，用於氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯等多種藥物的同時檢測，探討了擬除蟲菊酯酶聯免疫試劑盒的各項檢測性能，以達到保障農產品質量安全，提升菊酯類藥物快速檢測技術的目的。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
蔬菜樣本均購買於北京大型超市；擬除蟲菊酯類農藥標準品（中國藥品生物製品檢定所）；去離子水、濃縮洗滌液（磷酸緩衝液）（北京維德維康生物技術有限公司）。
1.2 儀器與設備
酶標儀（MK3型，美國Thermo）；離心機（TDL-40C型，上海安亭科學儀器廠）；渦動儀（HQ-60型，北京方正生物科技發展有限公司）；超純水儀（Milli-Q Academic A10型號，美國Milli-Q公司）；氮吹儀（N-EVAP型，美國Organomation公司）等。
1.3 方法
1.3.1 半抗原製備
半抗原結構一的合成：稱取500mg化合物1於50mL三口瓶中，加入10mL DMF溶解，加入160mg NaH（6.7mmoL）冰浴反應30min，加入琥珀酸酐室溫反應4h；石油醚∶乙酸乙酯=6∶1，點板化合物1反應完後，加水和乙酸乙酯萃取3次，將有機相合並後用無水硫酸鈉幹燥半小時，濃縮，得到的物質即為半抗原結構一。
半抗原結構二的合成：稱取500mg化合物1於50mL三口瓶中，加入10mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）溶解，加入160mg NaH（6.7mmoL）冰浴反應30min，加入鄰苯二甲酸酐室溫反應4h；石油醚∶乙酸乙酯=6∶1，點板化合物1反應完後，加水和乙酸乙酯萃取3次，將有機相合並後用無水硫酸鈉幹燥半小時，濃縮，得到的物質即為半抗原結構二。 1.3.2 人工抗原的製備
免疫原製備：將14.52mg半抗原結構一用1.5mL DMF溶解，200rpm攪拌10min，加入1-(3-二甲基胺丙基)-3-乙基碳二亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)3-ethylcarbodiimide，EDC）225.7mg，溶解後再加入NHS 20.3mg，室溫攪拌活化2~3h。稱取牛血清白蛋白50mg溶於3.5mL 0.1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌10min，使其充分溶解，冰浴降溫（0~4℃），1000rpm攪拌下，將步驟1反應液逐滴加入，500rpm攪拌反應24h。將反應產物裝入蒸餾水衝洗幹淨透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃攪拌（100rpm）透析3d，將透析產物5000rpm離心6min，將抗原編號，於-20℃下保存備用。
包被原製備：將24.8mg半抗原結構二用1.5mL DMF溶解，200rpm攪拌10min，加入EDC 38.35mg溶解後再加入NHS 23mg，室溫攪拌（500rpm）活化2~3h。稱取卵清蛋白50mg溶於3.5mL 0.1moL/L碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌10min，使其充分溶解，冰浴降溫至0~4℃，1000rpm下攪拌，逐滴加入（1mL/min）步驟1的反應液，500rpm攪拌反應24h。將反應產物裝入用蒸餾水衝洗幹淨的透析袋（10cm），加入1L 0.01M PBS（1×，pH7.2），4℃攪拌（100rpm）透析3d，每天換液3次，將透析產物5000rpm離心6min，將抗原編號，於-20℃保存備用。
1.3.3 抗體製備與純化
以研發的人工抗原新西蘭雌性大白兔為研究對象，采用背部皮下多點注射的方式進行免疫。首次用弗氏完全佐劑乳化人工抗原免疫，間隔一定時間後進行加強免疫（佐劑為IFA）。每種抗原的免疫劑量是每隻兔子1000μg，免疫間隔3周，收集得到的多抗血清用蛋白A親和柱進行純化，凍幹後於-20℃環境下保存。
1.3.4 ELISA方法的建立
取1.0±0.01g均質後的蔬菜樣品於50mL離心管中，加入5mL甲醇，充分渦動1min；4000rpm離心5min；取100μL上清液於新的離心管中，加入400μL樣品稀釋液，充分渦動30s；用於後續檢測。
用包被緩衝液稀釋包被抗原，每孔加入100μL，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30s，拍幹；在每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去封閉液，用洗滌液洗滌4次，每次30s，拍幹；依次將50μL各標準品工作液/樣品溶液、80μL酶標抗體工作液加入對應的標準品/樣本孔中，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下（25±2℃）避光反應40min；洗滌4次，拍幹；立即在每孔中加入100μL A、B混合液；蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下（25±2℃），避光反應10~15min；揭開蓋板膜，在每孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻；5min內用酶標儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標板吸光度值。
1.3.5 建立標準曲線
在空白標準溶液中加入擬除蟲菊酯（氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯），使標準品達到一係列濃度（0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43μg/L），根據實驗數據繪製標準曲線，並計算擬除蟲菊酯的半抑製濃度（IC50）。
1.3.6 試劑盒性能驗證
為了評價該分析方法和測量係統的準確性，采用空白樣品（不含擬除蟲菊酯類農殘）進行添加回收實驗，分別考察ELISA技術的檢出限、準確度、精密度以及特異性。
檢出限：分別測定20份小白菜、油菜、菠菜、圓白菜等蔬菜樣本，取其測定平均值加上3倍標準差（SD）即為本方法的檢出限。
特異性試驗：選取氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、聯苯菊酯、溴氰菊酯、樂果、對硫磷等常見農藥，計算各自的IC50，並按照下式計算交叉反應率—交叉反應率（CR%）=IC50（氯氰菊酯）/IC50（結構類似物）×100%。
準確度驗證：取空白小白菜、油菜、菠菜、圓白菜樣本分別添加5.0μg/L、10.0μg/L氯氰菊酯，6.0μg/L、15.0μg/L甲氰菊酯、溴氰菊酯，15.0μg/L、30.0μg/L順式氰戊，7.0μg/L、15.0μg/L氰戊菊酯，每個樣本進行5次平行試驗，並檢測，記錄檢測結果，計算回收率。
精密度驗證：隨機抽取3批次酶標板進行檢測，每個試驗重複5次，分別計算批內、批間變異係數。
儀器確證試驗：利用本研究開發的擬除蟲菊酯試劑盒和氣相色譜-質譜（GC-MS）分別對20個蔬菜樣本進行檢測，比對檢測結果，確定該檢測方法的準確性。
2 結果與分析
2.1 建立標準曲線
通過對抗原抗體製備，優化反應條件（抗原抗體濃度、包被方式、加樣體係、反應時間等），選擇IC50最低值作為最佳工作條件，此時靈敏度最高。標準曲線如圖所示，橫坐標為標準品溶液的濃度值（μg/L），縱坐標為不同濃度標準品的結合率（B/B0×100%），計算得R ²=0.995；IC50=0.47μg/L；標準曲線的線性範圍為：0.08~0.81μg/L。 2.2 交叉反應率
本研究所用的擬除蟲菊酯多克隆抗體與其它農藥的交叉反應率情況見表1，所研製的多克隆抗體可以實現氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯5種菊酯類藥物的同時檢測，並與其它藥物交叉反應率小於0.1，說明抗體特異性強，與其他藥物無交叉，檢測指標全麵，可以實現5種菊酯藥物的特異性檢測。 2.3 試劑盒性能驗證
2.3.1 檢出限驗證
分別對20份小白菜、油菜、菠菜、圓白菜等蔬菜空白樣本進行檢測，結果如表2所示，本試劑盒對小白菜、油菜、菠菜、圓白菜中擬除蟲菊酯的檢出限（LOD）分別為4.95μg/L、4.64μg/L、4.18μg/L、3.57μg/L，為保障試劑盒檢測結果的準確和穩定，設置本試劑盒的檢出限為5.0μg/L。由各項藥物的交叉反應率（如表1）可知，試劑盒對氯氰菊酯的檢出限約為5.0μg/L，對甲氰菊酯的檢出限約為6.0μg/L、順式氰戊的檢出限約為15.0μg/L、氰戊菊酯的檢出限約為7.0μg/L、溴氰菊酯的檢出限約為6.0μg/L。 2.3.2 ELISA方法的準確度、精密度驗證
通過添加藥物標準溶液計算試劑盒的回收率和批內、批間變異係數，來評價試劑盒的準確度和精密度。由表3可知，各種蔬菜樣本的添加回收率範圍為65.5%~109.6%；批內、批間變異係數均小於5%，說明所研製的擬除蟲菊酯酶聯免疫試劑盒具有良好的回收率，準確度較高，精密度達到了行業對於ELISA試劑盒要求的技術水平。

2.3.3 儀器確證試驗
從超市購買小白菜、菠菜、油菜、圓白菜樣本各20份，分別用擬除蟲菊酯試劑盒（檢出限為5.0g/L）和氣相色譜-質譜（檢出限為2.0g/L）進行檢測，低於檢出限用“

3 結論
目前，關於擬除蟲菊酯快速檢測方法的研究報道較少，使用常規儀器的檢測方法操作繁瑣，耗時長。本研究通過人工合成抗原，突破性地建立了“一步法”酶聯免疫方法，並研製了相應的酶聯免疫試劑盒來實現蔬菜中擬除蟲菊酯藥物殘留的快速檢測。此方法具有以下優點：
①所研製的多殘留試劑盒檢出限可低至5.0μg/L，與駱愛蘭、餘向陽、孫寧浩、張婧等人的單一藥物殘留檢測方法檢出限（分別為217.2g/L、0.2 mg/L、0.01~0.02mg/kg）相比靈敏度有顯著提高。
②半抗原合成路線簡潔，僅兩步反應即可完成抗原製備，最大限度的保留了藥物的公共部分，充分增加了交叉藥物種類，檢測指標覆蓋氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯5種擬除蟲菊酯藥物，與劉景坤、李誌茹、胡久平、文孟棠等人的單一藥物檢測報道相比，藥物覆蓋全麵，交叉反應率分布平均，更具廣譜性。
③本研究開發了“一步法”酶聯免疫方法，樣本前處理簡單，檢測過程操作步驟簡潔，可在1h內實現樣本檢測，能夠有效降低檢測成本。
④通過驗證所研製酶聯免疫試劑盒的檢出限、準確度、精密度，各項指標均符合我國殘留檢測標準的規定，並且通過實際樣本檢測也進一步證實了本方法的實用性。