目的：與美國農業部微生物實驗室指南8.08章參考方法進行對比，驗證Veriflow LS李斯特菌屬定性檢測方法的性能。方法及結果：本次性能驗證研究采用了6種不同環境樣品和食品基質來驗證Veriflow LS方法對於檢測低菌量李斯特菌的能力。在每個非配對的對比試驗中，陽性檢出率的結果顯示，Veriflow LS的檢測結果與參考方法無顯著性差異。參考方法對Veriflow LS檢測過的樣品的確認的結果顯示，Veriflow LS檢測結果無假陽性和假陰性。同時對51個李斯特菌屬和35個非李斯特菌屬進行了包容性驗證和排他性驗證，結果顯示包容性和排他性均為100%。總結：Veriflow LS是一個靈敏、選擇性強、耐用的環境表麵（不鏽鋼、混凝土、塑料和陶瓷的表麵）和即食食品基質（熱狗和熟火雞肉）中李斯特菌屬的檢測方法。
前言
李斯特菌屬（Listeria）既包括默氏李斯特菌等無致病性的李斯特菌，還包括伊氏李斯特菌、威爾斯李斯特菌、格氏李斯特菌和單增李斯特菌等具有致病性的種屬，其中單增李斯特菌對人類的危害最大，能夠引起人體食物中毒，引發骨髓炎、腦膜炎、心肌炎、孕婦流產以及產褥感染等。李斯特菌屬廣泛存在於自然界中，在4℃的環境中仍可生長繁殖，故而已引起公共衛生和 世界杯賽程預測領域的廣泛重視。正因如此，李斯特菌屬的快速檢測對於預防由該菌屬引發的食物中毒和食源性疾病具有重要的指導意義。傳統的李斯特菌屬檢測手段是培養法，包括預增菌（24h）、選擇性增菌（24h）、選擇性平板（48h）、生化反應等過程，是檢驗的“金標準”，但其費時費力、成本高、專業性強，顯然無法滿足快速檢測的需求。目前李斯特菌屬快速檢測方法主要有免疫方法和熒光PCR法，雖都可有效縮短檢測時間，但前者在致病菌檢測時存在較高的假陽性和假陰性，而後者的前處理通常操作複雜（需要核酸提取），對操作人員的要求高，成本高且存在氣溶膠引起的假陽性。因此，市場亟需一種更為簡便、高效且特異性強的李斯特菌屬快速檢測方法。
Veriflow LS是基於DNA分子技術開發的李斯特菌屬的快速檢測係統，適用於環境表麵和食品基質的檢測，隻需22小時的前增菌、60~90分鍾的擴增和3分鍾的層析檢測，即可得出檢驗結果。該方法將PCR技術與垂直流層析係統結合，無需提取核酸，具有高特異性和高靈敏度，同時采用專利的酶係統有效降低了假陽性和假陰性。本次實驗將Veriflow LS係統方法與傳統方法進行對比，驗證了Veriflow LS係統方法的性能。
1 方法原理
將采集的樣品增菌，然後取增菌液用於PCR擴增，最後將擴增產物直接加入到層析卡盒的加樣窗內，僅需等待3分鍾即可產生反應信號。拉動檢測卡盒上的開關，觀察檢測結果。檢測結果為陽性時，靶標分析物被捕獲並固定在測試膜上，在陽性線處生成視覺信號，在測試卡盒標記的“T”端，分析物聚集產生清晰的紅色檢測線；控製線同時在“C”區顯現，表明實驗的操作是正確的。兩條紅線表明樣品為李斯特屬陽性，而一條質控線則表明樣品為李斯特屬陰性。
2 實驗器材及樣品
對比方法（參考方法）：美國農業部微生物實驗室指南8.08章參考方法。
樣品基質：不鏽鋼表麵、混凝土表麵、塑料表麵、陶瓷表麵、熱狗和熟火雞肉。
Veriflow LS所需器材：Veriflow LS李斯特菌屬檢測試劑盒（含PCR試劑、層析檢測卡等）、IS PCR儀、移液器、金屬浴加熱器（95±2℃）。
菌種：各菌株分別來自ATCC、BEI、佛蒙特大學、賓夕法尼亞大學、NCTC和NCIMB。所有菌株都經參考方法確認。
3 實驗方法
3.1 實驗用菌懸液準備
單核增生李斯特菌：將菌種培養物增菌並添到樣品中，使樣品的陽性率在20%~80%即可用於Veriflow LS耐用性測試和批次間穩定性測試。具體步驟如下：菌株接種於BHI肉湯中至穩定期（含量約為1.5×10 ⁹CFU/mL），稀釋，取稀釋因子為10 ⁸的稀釋液100μL加入到50mL的李斯特肉湯中，混勻，從中取5mL加入到100mL李斯特肉湯中並於35±1℃培養22h。陰性對照菌：腸球菌ATCC 29212用BHI肉湯增菌直至穩定期，用於Veriflow LS耐用性和批次間穩定性測試。包容性測試菌株：51株李斯特菌屬菌株分別增菌，釋至50×LOD值（約為5.0×105CFU/mL），不經增菌直接上機檢測。排他性菌株：35株排他性菌株增菌至穩定期，該濃度用於Veriflow LS排他性測試。
3.2 Veriflow LS檢測流程
增菌方法：取樣品與適量李斯特肉湯混合，均質，35±2℃培養22h。樣品準備和PCR擴增：取增菌好的樣品500μL增菌液加入到配套的采樣管中，滅活10min後，移取5μL加到PCR試劑管中，放入擴增儀中並運行對應程序。層析檢測：在已完成擴增的PCR管子中加入4滴緩衝液B，層析檢測卡加樣窗內，等待約3min，即可打開層析檢測卡視窗獲取結果（2h內打開有效）。結果判讀：檢測卡視窗內隻有1條紅線（控製線），表明樣品為李斯特菌屬陰性；檢測卡視窗內有2條紅線（控製線和陽性線），則表明樣品為李斯特菌屬陽性。
3.3 實驗設計
3.3.1 耐用性驗證
Veriflow LS係統參數改變時，低菌量陽性樣和陰性樣（非李斯特菌屬）的檢測和分析一定程度上會偏離標準參數，因此要進行耐用性驗證。驗證實驗采用了析因設計（見表1），變更的參數分別為：滅活時間（8或12min±30s）、IS緩衝液B添加量（3滴或5滴）和LS層析檢測卡層析時間(1.5或2.5min±15s)。 3.3.2 批次間穩定性測試
本次實驗采用了3個獨立生產的批次，批次號分別為ML0032、ML0035和ML0037，每個批次分別在0個月、6個月和12個月的時間點（通過加速老化完成）進行了如表2所示的驗證實驗。每個時間點分別采用10個含0~9個目標菌（10個樣品中部分不含目標菌）的樣品和5個含非目標菌樣品進行驗證，具體實驗設計見表2。 3.3.3 特異性測試（包容性和排他性測試）
用準備好的包容性和排他性菌株菌懸液，不經增菌，按照Veriflow操作說明書進行分析檢測。（注：所有包容性驗證菌株的培養物都已經過參考方法確認。）
3.3.4 獨立方法對比實驗
實驗目的為比較Veriflow LS檢測方法和參考方法在檢測環境表麵樣品與即食食品樣品中李斯特菌屬的性能差異。由於Veriflow LS和參考方法的前增菌培養基不同，本次實驗對所有樣品基質都采用獨立的非配對方法進行分析檢測。(注：每個Veriflow LS檢測過的樣品都經參考方法確認並確保Veriflow LS檢測結果無假陽性或假陰性)。本次實驗的每種樣品都采用了30個樣品進行實驗，其中5個樣品未添加目標菌(濃度為0CFU/采樣量)，20個添加了低含量目標菌（濃度為0.2~2CFU/采樣量），另外5個添加了高含量目標菌(濃度為2~5CFU/采樣量)，並且每種樣品都添加不同李斯特菌。設計低含量添加樣品的目的是使20個樣品中部分樣品的結果為陽性，部分結果樣品的結果為陰性，比例在5/20~15/20之間，以比較兩種方法的結果是否存在陽性檢出率上的差異。
環境表麵樣品：將兩種檢測方法（Verilow LS和參考方法）所采用的各類環境表麵分別添加不同的李斯特菌以獲得不同程度汙染的表麵。不鏽鋼表麵和混凝土表麵采樣方法：10×10cm的表麵添加0.25mL菌懸液並用Hygeina海綿棒采樣。陶瓷和塑料表麵采樣方法：2.5×2.5cm表麵添加0.10mL菌懸液並用Hygeina Q-Swab拭子采樣。除添加李斯特菌之外，不鏽鋼表麵還添加了高於目標菌（李斯特菌）含量10倍的競爭性菌—糞腸球菌ATCC 29212。取樣前所有表麵都在室溫(24±2℃)下自然風幹16~24h，菌懸液都采用TSA培養基進行計數。采樣完成後，可按照兩種方法各自的操作說明進行後續檢測。
即食食品樣品：兩種食品基質添加了不同的李斯特菌。對每種食品基質添加陽性培養物稀釋液後在4±1℃下放置48~72h，將樣品分成適當份數並分裝於均質袋中，增菌並進行後續檢測。（添加的李斯特菌在50±2℃下熱應激10min便已失去50%的活力）。用MPN法對樣品中李斯特菌含量進行計數。采樣完成後，按照兩種方法各自的操作說明進行後續檢測。
3.3.5 數據統計
POD：在一定基質和一定待測物濃度下，定性分析方法獲得陽性分析結果數的比例。POD值與濃度有關，POD的計算公式為POD=陽性結果數量/試驗總數。以下幾個POD值分別為：PODR(參考方法POD)，PODC(被評估方法POD)，在95%的置信區間內評估POD值，包括PODR、PODC。
dPOD：兩個POD值之差，dPODC=PODC-PODR，計算dPODC的95%的置信區間。若置信區間不包括0，則兩種方法存在顯著性差異，反之則不存顯著性差異。
4 結果
4.1 耐用性和批次間穩定性結果
耐用性測試結果(見表1)顯示，在不同參數（包括滅活時間、緩衝液B添加滴數和層析卡層析時間）結合改變下，Veriflow係統性能不受影響，並且所有結果用參考方法進行陽性確認後都為真陽性。這些結果表明，一些係統參數的改變不會對係統的性能產生影響。
批次間穩定性結果（見表2）顯示批次間穩定性良好，每個批次和時間點的層析檢測卡具有一致的性能表現。這一結果同時也表明，Veriflow LS具有至少12個月的穩定保質期。
4.2 包容性和排他性測試
實驗結果顯示，Veriflow LS準確無誤地檢測出了51株不同的李斯特菌屬。另外，排他性結果顯示，Veriflow LS係統能夠準確無誤辨別李斯特菌屬之外的雜菌。（注：屎腸球菌ATCC 19434在非選擇性增菌培養基增菌後上機檢測出現了假陽性，但采用選擇性增菌培養基（ISLB）增菌後上機檢測則為陰性。）
4.3 環境樣品結果比較
4種表麵上分別添加3個不同濃度(不添加菌、低菌量和高菌量)的不同菌，采樣，最後用各自的方法進行檢測。添加低菌量表麵的檢測對比結果顯示，Veriflow LS係統方法和參考方法在不鏽鋼表麵樣品分別檢出12和8個陽性樣本，混凝土表麵樣品分別檢出15和14個陽性樣本，陶瓷表麵樣品分別檢出8和11個陽性樣本，塑料表麵樣品兩種方法則分別檢出了8和11個陽性樣本。4種表麵中，未添加李斯特菌屬的表麵兩種方法的結果均為陰性，添加高菌量的表麵兩種方法的結果均為陽性。所有Veriflow LS的結果都經參考方法確認，無假陽性和假陰性。同時，POD的分析結果顯示，Veriflow LS係統和參考方法的結果均不存在顯著性差異。
4.4 即食食品樣品結果對比
添加3個不同濃度李斯特菌屬的即食食品分析結果顯示：Veriflow LS係統方法和參考方法在20個低汙染的熟火雞肉樣品（0.22CFU/125g）中分別檢出了8例和7例陽性，20個低汙染的熱狗樣品中各自都檢出了13例陽性。兩種即食食品中，未添加李斯特菌屬的樣品兩種方法的結果均為陰性，添加高菌量的樣品兩種方法的結果均為陽性。所有Veriflow LS的結果都經參考方法確認，無假陽性和假陰性結果。同時，POD的分析結果(見表3）顯示，Veriflow LS係統的結果和參考方法的結果不存在顯著性差異。

5 討論與結論
本次實驗結果表明，與傳統參考方法相比較，Veriflow LS檢測係統在檢測環境（不鏽鋼、混凝土、塑料和陶瓷的表麵）和即食食品（熱狗和熟火雞肉）中李斯特菌屬時具有很好的特異性、準確性和可靠性。6種基質的POD值數據分析均顯示，Veriflow LS係統方法的和參考方法的性能不存在顯著性差異。高特異性（包容性和排他性）也是本次驗證實驗成功的關鍵之一，特異性試驗的結果顯示，Veriflow LS係統能準確無誤的識別出樣品李斯特菌屬而不受其他非李斯特屬的雜菌的幹擾，有效提高檢出率。
Veriflow LS李斯特菌屬檢測係統無需複雜的前增菌過程，也無需複雜的前處理（無需DNA提純），且經多種表麵樣品（海綿棒或拭子采樣）和食品基質的驗證，具有良好的準確度，可為終端用戶提供靈活便捷的使用體驗。同時，相較於參考方法中冗長的實驗流程（參考方法需3~4天的檢測時間），Veriflow LS檢測係統能節省大量的時間—隻需24小時的前增菌和2小時的擴增時間即可獲得準確的結果。批次間的穩定性測試也表明，Veriflow LS的試劑盒是具有重複性好、耐用和生產質量穩定等優點的李斯特菌屬檢測試劑盒。本次實驗的結果也表明，操作簡單的Veriflow LS檢測係統可以提供一種靈敏、可靠和易用的環境樣品和食品基質中的李斯特菌屬的檢測方法。