近年來，市場上出售的部分羊肉卷中摻有大量鴨肉的2022世界杯預選賽最新排名 屢被報道，甚至有老鼠肉的2022世界杯預選賽最新排名 ，商家通過摻假賺取非法利潤，“掛羊頭賣狗肉”欺騙消費者，侵犯消費者合法權益，這種現象在中國已是行業內默認的“潛規則”。目前有效準確的摻假檢測方法十分有限，隻有個別檢測機構利用聚合酶鏈式反應技術（PCR）擴增這些物種特有的DNA，但這種方法並不能直接檢測肉類的主要成分—蛋白質，而且肉類處理加工過程會輕易地破壞和去除這些DNA。這樣一來，就算食品樣品中含有大量的鴨或老鼠組織和其他一些汙染物也無法被檢測出來。還有一種補充方法—酶聯免疫吸附法（ELISA）也可以進行蛋白質檢測，但是這種方法一次隻能檢測單個蛋白質，不能同時檢測多個物種，反應特異性也不好。 肉類來源物種檢測最大的困難是如何找到特定物種的特異蛋白質或肽，由於以上兩種方法特異性並不高，可能會存在假陽性結果，所以急需開發出一種快速、準確和特異性更高的檢測方法。
首先采用高靈敏度、高掃描速度的AB SCIEX Triple TOF ^TM5600質譜係統鑒定各肉類的蛋白質，通過比較分析尋找各肉類物種蛋白質特異的肽，經過blast進一步篩查和確認，然後再在AB SCIEX QTRAP® 4500係統上利用 MIDAS ^TM工作流程建立起多重反應監測（MRM）檢測假羊肉的方法。主要目的是建立一套簡單易用的MRM檢測假肉方法，不再需要複雜的方法開發過程，而且該方法可以很方便地將新的需要檢測物種的MRM離子對加進去，在一個方法裏可以同時檢測多個特征肽和多個物種。另外QTRAP®質譜可以利用MRM觸發的增強離子掃描方式進一步確認蛋白質/肽序列，從而有效去除假陽性的可能，增加檢測結果的可靠性。最終檢測方法可以利用純鴨肉或雞肉樣品來繪製標準曲線，從而很容易計算出樣品中摻入假肉的比例和量。所以質譜檢測方法要比PCR、ELISA 或其他非直接檢測方法更簡易、更準確和更可靠。
方法
材料
本文所用的肉類樣品：鴨肉、雞肉、羊肉、牛肉、豬肉、兔肉，均從市場購買，摻假樣品羊肉卷是從某大型超市購買，大鼠肉來自實驗用大鼠腿部肌肉。
樣品製備
首先取2g肉樣均質，加入液氮研磨成粉狀，然後加入蛋白提取液（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS），離心取0.1mL上清液並轉移到超濾管中，加入二硫蘇糖醇在60℃條件下保持60分鍾還原二硫鍵，然後加入碘乙酰胺室溫避光反應30分鍾進行烷基化，加入200μL50mmol/mL碳酸氫銨溶液，14000g離心20分鍾，重複3次，最後加入100μL含有胰蛋白酶的50mmol/mL碳酸氫銨溶液震蕩混勻，40℃酶解3小時。
特征肽的找尋
采用Eksigent nanoLC-Ultra®液相係統和AB SCIEX Triple TOF ^TM5600質譜係統鑒定各物種肉類蛋白質，每個樣品上樣2μg總蛋白。采用75μm內徑柱子30分鍾梯度分析時間。用Protein Pilot ^TM軟件進行蛋白質數據庫檢索，所用數據庫是NCBInr全庫，選用了氨基酸替換搜索功能。
通過詳細比較在各個物種肉類鑒定的蛋白質和肽列表，找到隻在鴨肉或雞肉樣品裏鑒定的特異肽，即這些肽可以作為鴨或雞的特異標誌物，且這些肽對應的蛋白質必須是幾個物種裏都能鑒定到的，隻是肽的氨基酸序列有差別，並且盡量選用高豐度蛋白質對應的肽。最後將這些特征肽再在NCBI網站上進行blast分析，進一步確認其特異性，即這些肽的氨基酸序列不能與其他幾個物種100%匹配。
MIDAS ^TM工作流程建立
MRM檢測方法
采用Shimadzu 20AD XR液相係統和AB SCIEX QTRAP® 4500質譜係統構建MIDAS ^TM工作流程、建立MRM檢測方法。每個肉類樣品取2μg總蛋白，經過22分鍾的液相梯度條件分離，其中的A相為0.1%甲酸的水溶液，B相為0.1%甲酸的乙腈。色譜柱采用Phenomenex Kinetex 4.6mm×100mm，2.6um，100A反向C18色譜柱，流速0.4mL/min，40℃柱溫。
表 1 MRM檢測液相分離條件

Time（min）	A（%）	B（%）
1	90	10
15	65	35
16	10	90
18	10	90
18.1	2	10
22	98	10

MIADS ^TM工作流程
質譜檢測是在配有電噴霧電離源（ESI）的AB SCIEX QTRAP®4500質譜平台上完成的。MRM觸發EPI方法是基於MIDAS ^TM工作流程開發完成。
基本思路：首先，利用Skyline軟件構建鴨和雞的特征肽的MRM離子對和QTRAP®的MRM觸發EPI實驗方法。然後在7個肉類樣品中逐一進行篩選和確認，根據同一個肽的MRM離子對的保留時間和MSMS質譜碎片離子與鑒定實驗的匹配性去掉在其他肉類出現的MRM離子對，保留特異的MRM離子對，並進一步優化DP、CE等質譜參數。
最終確定的質譜方法中，TurboV ^TM離子源參數為：gas1、gas2和氣簾氣為50psi，源溫度設為550℃，噴霧電壓為5500V。采用Scheduled MRM ^TM算法進行檢測：MRM檢測窗口設置為30秒，掃描時間設置為0.6秒。EPI掃描速度10000Da/s，掃描質量範圍：250~1200Da，DP電壓50v，CE能量40±15V。
摻入最低定量檢測限LLOQ
將鴨肉和雞肉蛋白樣品按比例稀釋加入到羊肉蛋白樣品中，羊肉蛋白總量維持在2μg，以此確定鴨肉和雞肉摻入羊肉中的最低定量檢測限。用Multiquant ^TM軟件自動積分並繪製標準曲線並計算CV值和準確度。
鴨和雞特征肽找尋
肉類鑒定的方法開發最關鍵的是找尋某一物種特征肽。眾所周知，一些物種親緣關係比較近，蛋白序列差別很小，比如雞和鴨、羊和牛等。還有一些物種的蛋白數據庫非常稀缺，比如鴨和羊，這樣找尋這些物種特征肽存在一定的難度，因此實驗采用Triple TOF ^TM質譜係統和Protein Pilot ^TM軟件先鑒定這些物種肉樣品包含的蛋白質，充分利用Triple TOF ^TM質譜係統強大的蛋白質鑒定能力和Protein Pilot ^TM軟件優越的蛋白同源分析能力和物種分組能力。而且通過檢索NCBInr所有物種的蛋白庫，這樣很容易在Protein Pilot ^TM軟件中確定一些物種同源的蛋白質和肽，並且比較容易地找到某物種特異的肽，即使鴨或羊的數據庫不全，也可以通過Protein Pilot ^TM軟件氨基酸替換檢索方式找到鴨的特征肽序列。最後在最全的蛋白數據庫NCBI網站做blast分析，進一步確認這些特征肽的物種特異性，將非特異的肽淘汰掉，保留特異肽。
筆者從某大型超市裏隨機購買的羊肉卷裏就鑒定出了大量的禽類來源蛋白質，由於鴨蛋白質數據庫不全，加上鴨和雞親緣關係比較接近，所以顯示的蛋白來源物種基本是原雞，這已經提示這些羊肉卷裏確實摻入了某種禽類肉，但無法確定具體是摻入什麼肉。通過尋找的特征構建的MRM方法檢測最終顯示這些羊肉卷裏主要摻入了鴨肉而非雞肉，這就表明MRM方法比蛋白鑒定方法結果特異性更好，所以最終確定開發MRM檢測方法。
MIDAS ^TM工作流程確認特征
MRM離子對
AB SCIEX QTRAP®係列質譜最大的優勢是將串聯四級杆的高選擇性MRM掃描和離子阱高靈敏度的碎片離子掃描即EPI組合在一起，從而可以實現MIDAS ^TM工作流程，這樣MRM峰可以得到二級圖譜的進一步確認，有效消除假陽性的MRM峰。比如在用雞的特征MRM方法分析兔肉樣品時，在15.5分鍾出現很明顯的MRM峰，但其觸發的二級圖譜去做圖庫檢索發現此MRM峰匹配到另外一個肽並不是設定的雞的特征肽。這說明單純的MRM峰並不一定能判定兔肉中有雞肉成分，需要MSMS圖譜進一步確認。
鴨肉和雞肉的最終特征
MRM檢測方法的確立 通過以上流程可以確定，鴨的特征MRM檢測方法在純雞肉、純羊肉、純牛肉、純豬肉、純兔肉和純大鼠肉樣品中都沒有檢測出相應的MRM峰，在純鴨肉樣品中檢測出強度很高的MRM峰，證明了該方法的專一性和可靠性。但在超市購買的羊肉卷裏檢測出很強的MRM峰，與在純雞肉裏出現的MRM峰一致，證明此羊肉卷確實是摻入了鴨肉，是假羊肉卷。
通過以上流程，確定雞的特征MRM檢測方法在純鴨肉、純羊肉、純牛肉、純豬肉、純兔肉和純大鼠肉樣品中都沒有檢測出相應的MRM峰，在純鴨肉樣品中檢測出強度很高的MRM峰，證明了該方法的專一性和可靠性。同樣在超市購買的假羊肉卷裏沒有檢測到雞的特征MRM峰，證明此羊肉卷裏沒有摻入雞肉。
羊肉中摻入鴨肉和雞肉最低
定量檢測限
通過人為方法將鴨肉和雞肉蛋白按比例依次稀釋加入到2μg的羊肉蛋白裏，用最終確定的鴨肉特征MRM方法和雞肉特征MRM方法來確定最低定量檢測限，鴨肉和雞肉蛋白從2μg開始摻入，每個稀釋重複3次。最終確定鴨肉最低定量檢測限可以達到 4ng，最低摻入比例為0.2%，從4~2000ng呈現良好的定量線性。雞肉最低定量檢測限達到20ng，最低摻入比例為1%，從20~2000ng呈現良好的定量線性。定量重現性良好，在最低濃度條件下，CV在5%以內。這樣的最低定量檢測限和最低參入比例完全可以滿足日常的肉商檢測的需要。並可以非常容易地以此標準曲線測得假羊肉裏摻入鴨肉或雞肉的比例和摻入的絕對量。
液質聯用技術為肉類物種來源檢測提供了一種快速、穩定、靈敏、特異的方法，本方法的靈敏度可以媲美任何現有的ELISA方法或PCR方法。而且液質聯用的方法可以同時檢測多種生物物種，遠遠好於ELISA每次隻能分別檢測某種生物。使用MIDAS™工作流程可以在定量的同時，進行QTRAP®二級全掃描獲得定性確認信息，與其他檢測方式相比大大減少了假陽性的概率。
本文給出了肉類物種來源分析的一種通用流程，即用AB SCIEX TripleTOF ^TM係列快速采集質譜係統和ProteinPilot ^TM軟件鑒定各個物種蛋白質，然後分析找到某些物種的特征肽，再進行blast分析篩選確定特征肽，然後轉到AB SCIEX QTRAP ^?質譜係統上進行MIDAS ^TM流程，確定最終的特征肽MRM檢測方法。
本文建立了鴨肉和雞肉物種來源檢測的MRM方法，實驗表明此方法具有很高的靈敏度、特異性、重現性和極低的線性定量檢測限，並且在市場上出售的假羊肉卷樣品中得到實際應用，也表明此方法完全可以應用在日常的羊肉卷摻入鴨肉或雞肉的實際檢測中。最終可以通過繪製標準曲線很容易計算出在羊肉卷裏摻入的鴨肉和雞肉比例和絕對量。
本文建立的MRM檢測方法簡單易用，不需要再進行複雜繁瑣的方法開發過程，可以直接用來檢測羊肉中摻入的鴨肉和雞肉，並且該方法的通量高，具有很好的擴充性，可以方便加入新的需要監測的物種MRM離子對，一個方法裏可以同時檢測多個物種。