番木瓜水溶性多糖的提取、分離與結構分析
分別采用常規水提醇沉和複合酶法,從番木瓜中提取水溶性粗多糖。苯酚-硫酸法測定多糖含量分別為36.48%和53.82%。粗多糖經脫蛋白,大孔吸附樹脂脫色,透析及DEAE-纖維素52型陰離子交換層析,得到番木瓜精多糖CPP1和CPP2。Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱層析和醋酸纖維素薄膜電泳初步表明CPP1和CPP2為純度較高的均一組分。紅外光譜分析發現典型多糖吸收峰。離子色譜分別測得CPP1、CPP2的主要單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。實驗結果表明,兩者均為結構複雜的雜多糖,是首次從該植物中分離得到。
材料與儀器
主要材料與試劑
番木瓜(Carica papaya L.):廣州天河區石牌菜市場銷售的夏威夷“Sunrise”品種番木瓜。
Sepharose 6B和各標準單糖:美國Pharmacia公司;AB-8型大孔吸附樹脂:天津南開大學化工廠;牛血清蛋白:上海伯奧生物科技有限公司;DEAE-52(進口分裝),考馬斯亮藍G-250,大茴香醛,果膠酶(酶活力單位≥50萬u/g):國藥集團化學試劑有限公司;纖維素酶:廣東光華化學廠有限公司;其它試劑均為國產分析純。
主要儀器與設備
ICS-2500型色譜儀:美國Dionex公司;Equinox 55型傅立葉變換紅外光譜儀:德國Bruker公司;D-1冷凍幹燥機:北京博醫實驗儀器有限公司;BS2-100自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠有限公司;Spectrum Lab 53型紫外分光光度計:上海棱光技術有限公司;JY 600電泳儀:北京君意東方電泳設備有限公司。
實驗方法
粗多糖的提取
複合酶法:在熱水浸提前,調整溫度至50℃,pH值至4.0,將1 g/L纖維素酶溶液和濾渣液以5:100的體積比混勻,保溫2h。再以相同比例加入1g/L果膠酶溶液,調整pH值至3.5,50℃保溫2h後,按常規法操作提取多糖。
多糖的純化
脫蛋白質:將木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶配製成1g/L的酶溶液,粗多糖用少量蒸餾水溶解,將酶液及多糖液以體積比5:100混勻,55℃保溫2h。再按多糖水溶液體積1/3~1/4加入Seveg試劑(氯仿:正丁醇=4:1),混合振蕩20min,重複操作10次以上,直至除盡蛋白質。
脫色素:預先用蒸餾水把AB-8型大孔吸附樹脂浸泡過夜。抽濾後,分別用質量分數為5%的HCl、5%的NaOH浸泡6h,使其充分溶脹。經蒸餾水衝洗至中性後,再用質量分數為95%的乙醇繼續浸泡6h,最後用蒸餾水洗至無乙醇味。稱取450g經預處理的樹脂裝入層析柱(45mm×600mm),蒸餾水平衡24h。取120mL經脫蛋白的多糖溶液進行上柱,以蒸餾水洗脫,收集洗脫液置100mL錐形瓶中。經TLC點板跟蹤檢測多糖洗脫進程。
脫鹽:將脫色後的多糖溶液,置於半透膜透析袋(截留分子量14000Da)中,紮緊袋口後在大燒杯中室溫下用蒸餾水透析80h。透析過程中,用磁力攪拌器保證透析袋處於流動狀態,中間換水9次,以除去鹽類及低聚糖等小分子雜質。將袋內的多糖溶液真空濃縮,95%乙醇沉澱,真空幹燥即得番木瓜純化多糖CPP。
多糖的分級:稱取100g DEAE-52纖維素,用蒸餾水浸泡過夜後抽濾,分別用0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、0.5mol/L NaOH浸泡1 h,再用蒸餾水依次處理至中性。抽氣裝入層析柱(25mm×600mm),蒸餾水平衡24h。稱取0.7g番木瓜純化多糖CPP,溶於適量蒸餾水中,上柱,分別用0.0,0.2,0.4,0.6mol/L NaCl溶液洗脫。控製流速為1mL/min,自動部分收集器收集,10mL/管,各管取樣,以苯酚-硫酸法隔管跟蹤檢測,作洗脫曲線,合並同一洗脫峰的各管樣品。洗脫液經過真空濃縮、透析、冷凍幹燥、得白色番木瓜多糖洗脫組分CPP1和CPP2。
多糖純度的鑒定
凝膠色譜法:將Sepharose 6B經蒸餾水溶脹處理後裝柱(20mm×300mm),用蒸餾水平衡24h。將番木瓜多糖洗脫組分CPP1和CPP2分別溶於0.1mol/L NaCl溶液中,上柱,檢查番木瓜多糖的純度。以0.1mol/L NaCl溶液洗脫,流速為1mL/min,自動部分收集器收集,每管收集5mL,用苯酚-硫酸法隔管跟蹤檢測多糖,作洗脫曲線。
結果與分析
粗多糖的提取在相同條件下,常規水提醇沉法和複合酶法分別進行3次平行實驗。複合酶法的番木瓜粗多糖平均得率為15.87%,苯酚-硫酸法測定其多糖含量為53.82%。而常規水提醇沉法提取粗多糖,得率僅為13.17%,多糖含量在36.48%左右。采用常規熱水提取法時,多糖很難從細胞壁中釋放出來,得率低。酶法提取與常規熱水浸提法相比,不僅使提取的條件更為溫和、更有針對性,效率更高,且番木瓜粗多糖的得率及含量均有顯著提高,初步證明是一種理想的提取方法。
粗多糖的純化粗多糖經脫蛋白、脫色、脫鹽後,外觀形態為大小均一的純白色細粉末顆粒。這表明AB-8大孔吸附樹脂對多糖色素吸附效果顯著。
多糖的分級純化多糖經DEAE-52纖維素柱層析,在用0.0~0.6mol/L NaCl溶液梯度洗脫下,共出現兩個顯著單一對稱峰,DEAE-52纖維素柱分離效果較好。對兩個主導洗脫組分進行收集,並作進一步的純度鑒定和結構分析。兩個組分分別記為CPP1和CPP2,其中CPP1屬於中性多糖,CPP2為酸性多糖。
多糖純度的鑒定
Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱層析:將DEAE-52纖維素分離獲得的多糖CPP1和CPP2,加入至Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱進行洗脫,CPP1的洗脫曲線上一共出現了三個洗脫峰。兩個相對狹窄的小峰出現在第13至22號試管中。但兩個雜峰隻占了很小的比例,表明多糖CPP1的純度較高,其分子達到了一定的均一程度。多糖CPP2的洗脫峰單一對稱,顯示樣品為均一多糖,即番木瓜多糖已被純化。
多糖的結構分析
紅外全波長掃描:多糖CPP1和CPP2經紅外光譜檢測,從紅外光譜圖可知,CPP1和CPP2都具有典型的多糖吸收峰,並且兩者結構相似,其特征吸收峰及所對應的功能基團見表1。
圖1 CPP1和CPP2紅外吸光光譜
離子色譜法測定:經過與標準樣色譜圖對照,多糖水解液CPP1與CPP2都含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖等五種單糖。並且五種單糖在CPP1樣品中的摩爾比例很接近,為15.13:16.87:26.17:17.92:10.26。但在樣品CPP2中,葡萄糖是最主要成分,其含量達到88.25%。這一結果也與IR分析一致。因為在CPP2的IR圖譜中,在856 cm-1處的伸縮振動峰表明CPP2中含有α-D-吡喃葡萄糖。
另外除了單糖,一定含量的雙糖海藻糖也存在於CPP1與CPP2的兩個樣品中。這表明多糖的水解還沒有完全。海藻糖是由兩分子葡萄糖組成的二糖,因此番木瓜兩種多糖的實際葡萄糖含量會更高。
複合酶法與常規水提醇沉法相比,具有高提取率、高選擇性的特點。酶法的提取率和粗多糖含量分別為15.87%和53.82%。而常規方法的提取率和粗多糖含量僅為13.17%和36.48%。
番木瓜粗多糖經脫蛋白、脫色、脫鹽和DEAE-52纖維素柱層析後,獲得番木瓜多糖CPP1和CPP2兩個組分。經Sepharose 6B和醋酸纖維膜電泳試驗,初步證明番木瓜多糖CPP1和CPP2均為純度較高的單一組分。離子色譜測得CPP1和CPP2都是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成。實驗結果表明,兩者均為結構複雜的雜多糖,是首次從該植物中分離得到。
唐若宓廣東省輕工業高級技工學校
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