豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS）又名“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種主要以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬呼吸道症狀及高死亡率為特征的高度接觸性傳染病 ^[1]。PRRS於1987年在美國首次發現，1991年荷蘭中央獸醫研究所首次分離得到病毒，我國在1996年首次報道 ^[2]。
在我國，豬群感染PRRSV後出現混合感染、繼發感染的現象非常嚴重，這與PRRSV的感染機製有關。PRRSV感染機體後以機體免疫係統細胞為靶細胞，從而抑製免疫係統功能，導致其他病原極易乘虛而入。無論感染了傳統PRRSV還是高致病性PRRSV，被感染的豬均會表現出豬呼吸障礙等多種症狀，臨床上多與副豬嗜血杆菌、大腸杆菌、鏈球菌、支原體等有關。試驗證明，高致病性PRRSV感染可以加劇副豬嗜血杆菌感染，引發嚴重的臨床表現 ^[3]。
由於PRRSV可在宿主體內的巨噬細胞中進行複製，導致無症狀的持續感染。該病毒通過鼻黏膜和上呼吸道上皮細胞進入宿主體內，並在鼻黏膜、呼吸係統的巨噬細胞以及淋巴組織中進行原發性複製。隨後通過血液循環到達繼發性複製部位，如大腦、心、肺、胸腺、脾、肝、淋巴結、腎、腎上腺、小腸、睾丸等。病毒可進入易感妊娠母豬體內，跨越胎盤感染胎兒。
PRRS血清學診斷方法是應用最廣泛的動物疫病診斷方法。關於PRRSV的血清學診斷，國內外己建立了多種檢測PRRSV抗體的方法，主要有免疫過氧化物酶單層實驗（immuno peroxidase monolayer assay，IPMA） ^[4]、間接免疫熒光檢測方法（indirect immunoin fluscent assay，IFA） ^[5]、血清中和試驗（Serum Neutralization，SN） ^[6]以及酶聯免疫吸附測定試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。目前許多國家己把酶聯免疫吸附試驗作為PRRS日常監測和臨床診斷的常規手段，因其抗原用量很少，檢測過程依靠儀器自動化，故而適合大規模的快速檢測。
核衣殼蛋白N作為PRRSV主要的結構蛋白，具有很強的免疫原性，是該病毒ELISA診斷方法中應用最多的靶抗原 ^[7]。間接ELISA方法是利用酶標記的二抗（辣根過氧化物酶HRP標兔抗豬IgG）以檢測與固相PRRSV抗原結合的PRRSV受檢抗體，故稱為間接法。間接法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷，此法與直接法類似，區別在於把沒有酶標記的一級抗體改用酶標記過的二級抗體去辨識一級抗體來測定抗原量。其優點在於利用二抗可以加強信號，隻需通過變換包被的抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相對應抗體的方法，完成不同的測定分析 ^[8]。由於酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
1 材料與方法
1.1 材料
重組PRRSV-N蛋白、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗豬IgG、176份豬血清。
1.2 方法
包括對蛋白質包被濃度、包被緩衝液、封閉液、封閉條件、稀釋倍數、作用時間及溫度、以及最佳顯色時間及溫度等指標的確定。
2 方法驗證
2.1 特異性試驗
用建立的PRRSV-N ELISA檢測方法分別檢測豬瘟陽性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、豬乙型腦炎病毒陽性血清、豬細小病毒陽性血清。計算S/P值，並對結果進行分析。
2.2 重複性試驗
用同批次抗原包被酶標板檢測同一份血清抗體來檢測板間與板內變異及批間差異，計算同一份檢測樣本陽性百分率的變異係數(C.V.=S/X×100%，S：標準差，X：算術平均值)，以檢驗板內和板間檢測樣品的重複性。
2.3 與商品化試劑盒的對比
用本試驗建立的PRRSV-N抗體ELISA檢測方法對美國IDEXX公司PRRSV抗體間接ELISA試劑盒檢測過的179份血清進行檢測。
3 實驗結果與分析
3.1 蛋白質最佳包被濃度確定的結果
通過對4個濃度包被的酶標板進行實驗，結果表明PRRV-N蛋白稀釋到1g/mL時，樣本的P/N值最大，效果最好。在所建立的ELISA檢測方法中，確定包被抗原濃度為1g/mL，實驗結果見表1。
表1 抗原包被濃度測定結果

抗原濃度 （g/mL） Antigen Concentration	陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血清OD450nm Negative Serum	P/N
2	2.52	0.41	6.14
1	2.01	0.19	10.58
0.5	1.66	0.19	8.74
0.25	0.93	0.15	6.20

3.2 最佳包被緩衝液確定的結果
利用3種包被緩衝液包被抗原，通過實驗，最終得出0.05moL/L碳酸鹽緩衝液的P/N在3種包被緩衝液中最大、最適於本方法中的抗原包被，實驗結果見表2。
表2 包被緩衝液選擇結果

包被緩衝液 Coating Buffer	陽性血OD450nm Positive Serum	陰性血清OD450nm Negative Serum	P/N
0.01mol/LPBS	0.92	0.19	4.84
0.05mol/ L碳酸鹽緩衝液	1.12	0.18	6.22
0.01mol/ L檸檬酸鈉	0.806	0.16	5.04

3.3 最佳封閉液確定的結果
通過8種封閉液對包有抗原的酶標板進行封閉，實驗最終確定封閉液為5%脫脂乳，P/N值最大且陽性值接近1.0、陰性值小於0.2，實驗結果見表3。
表3 最佳封閉液選擇結果

封閉液 Blocking Solution	陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血清OD450nm Negative Serum	P/N
0.5%PVA	0.69	0.15	4.77
1%明膠	0.93	0.17	5.54
5%脫脂乳	0.99	0.17	5.83
0.5%PVA+1%明膠	0.75	0.13	5.76
1%BSA	0.77	0.15	5.23
0.5%PVA+1%明膠+1%酪蛋白	0.75	0.15	5.06
5%馬血清	1.04	0.54	1.91
5%馬血清+1%明膠	0.94	0.45	2.08

3.4 最佳封閉條件確定的結果
通過在不同溫度下封閉，得出實驗結果為25℃條件下P/N值最大且陽性血清OD值與陰性血清OD值之差較大，最適合封閉，封閉條件為25℃反應2h，實驗結果見表4。
表4 確定封閉條件結果

溫度（℃） Temperature(℃)	陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血OD450nm Negative Serum	P/N
25	0.98	0.14	7.00
37	0.94	0.24	3.91

3.5 被檢血清最佳稀釋倍數確定的結果
通過倍比稀釋的方法對同種血清稀釋5個倍數，進行實驗，結果表明按照1:40的比例被稀釋時樣本P/N值最大，被檢血清稀釋倍數為40倍，實驗結果見表5。

3.6 被檢血清最佳作用時間及溫度確定的結果
通過實驗結果可以看出被檢血清在25℃反應30min和45min的陰陽性血清OD值和P/N值幾乎一樣且最高，為了節省實驗時間，將被檢血清的作用時間及溫度定為25℃反應 30min，實驗結果見下表6。
表6 被檢血清作用時間及溫度結果

反應條件 Reaction Conditions		陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血清OD450nm Negative Serum	P/N
25℃	30min	1.97	0.12	16.42
	45min	1.96	0.13	15.08
	60min	1.20	0.11	10.91
37℃	30min	0.99	0.12	8.25
	45min	0.97	0.15	6.47
	60min	0.77	0.07	11.00

3.7 酶標二抗最佳工作濃度確定的結果
通過倍比稀釋的方法將羊抗豬稀釋為不同濃度的酶標抗體工作液並進行實驗，實驗確定最佳酶標抗體工作濃度為1:20000稀釋，實驗結果見表7。
表7 最佳酶標抗體工作濃度的選擇結果

工作濃度 Working Concentration	陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血清OD450nm Negative Serum	P/N
1:10000	1.13	0.19	5.95
1:20000	1.01	0.16	6.31
1:30000	0.91	0.15	6.07
1:40000	0.74	0.14	5.29

3.8 酶標二抗最佳反應時間及溫度確定的結果
通過對不同酶標抗體反應時間及溫度的測定，試驗確定最佳酶標抗體作用時間為25℃反應30min，實驗結果見表8。
表8 酶標二抗反應時間及溫度測定結果

反應條件 Reaction Conditions		陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血清OD450nm Negative Serum	P/N
25℃	30 min	1.91	0.17	11.24
	45 min	1.89	0.17	11.12
	60 min	1.20	0.20	6.00
37℃	30 min	0.96	0.20	4.80
	45 min	0.97	0.19	5.11
	60 min	0.77	0.12	6.42

3.9 最佳顯色時間及溫度確定的結果
通過對不同顯色時間溫度的測定，試驗確定最佳顯色條件為25℃顯色10min，實驗結果見表9。
表9 最佳顯色時間及溫度測定結果

反應條件 Reaction Conditions		陽性血清OD450nm Positive Serum	陰性血OD450nm Negative Serum	P/N
25℃	5min	0.52	0.14	3.71
	10min	1.26	0.17	7.41
	15min	0.8	0.15	5.33
30℃	5min	1.00	0.25	4.00
	10min	1.52	0.21	7,23
	15min	1.32	0.24	1.33

3.10 特異性試驗結果
用建立好的ELISA方法檢測其他4種常見的豬傳染病陽性血清，結果均為陰性，PRRSV-N包被抗原與4種常見的豬傳染病陽性血清無交叉反應，表明以重組PRRSV-N蛋白為包被抗原檢測PRRSV抗體的間接ELISA擁有良好的特異性，檢測結果見表10。
表10 PRRSV-N抗體間接ELISA特異性檢測結果

	豬瘟 CSF	偽狂犬 PRV	乙腦 JE	豬細小 PPV	陽性對照 Positive Serum	陰性對照 Negative Serum
OD450nm	0.122	0.025	0.068	0.087	1.102	0.064
S/P	0.110	0.023	0.061	0.078
判定結果	-	-	-	-

3.11 重複性試驗結果
用同批次抗原包被酶標板檢測同一份血清抗體來判定板間與板內的變異及批間差異，結果顯示：批內板間與板內重複性試驗變異係數都在3.22%~7.86%之間；批間變異係數在11.57%，前者小於10%，後者小於20%，表明此間接ELISA檢測方法具有較好的重複穩定性。
3.12間接ELLSA方法與同類商品化試劑盒的對比
通過對建立的PRRSV-N抗體ELISA試劑盒與美國IDEXX-ELISA試劑盒進行實驗比較分析，證明PRRSV-N抗體ELISA試劑盒與美國IDEXX-ELISA試劑盒的符合率比較好，總體符合率達到85.22%，敏感性85.83%，特異性83.93%，可用於PRRSV-N抗體的臨床檢測，比較結果見表11。
表11 PRRSV-N抗體間接ELISA與商品化試劑盒的比較結果

建立的ELISA體係 Established ELISA system	IDEXX ELISA		合計
	+	-
+	103	9	112
-	17	47	64
合計	120	56	176

4 討論
本研究中將PRRSV-N蛋白用0.05moL/L碳酸鹽緩衝液稀釋到1g/mL後，進行包被（4℃，16h）。用0.5%脫脂乳在25℃條件下進行封閉2h，節省了抗原的使用量，並且在封閉時節約了時間，降低了生產成本。酶標抗體稀釋20000倍，在室溫（25℃±2℃）下反應30min，較為節省試驗時間，並且具有良好的敏感性和特異性。本實驗與國外同類型試劑盒檢測結果進行對比，陰性符合率為83.93%，陽性符合率為85.83%，總符合率為85.22%。說明本實驗建立的豬繁殖與呼吸綜合征病毒間接ELISA檢測方法具有較好的特異性和靈敏性，為下一步豬繁殖與呼吸綜合征試劑盒調試和生產提供了良好的試驗基礎。
參考文獻：
[1] 殷震，劉景華．動物病毒學(第二版)[M]．北京：中國科學出版社，1997：1019-1029．
[2] 譚斌，劉長明，危豔武．PRRSV_IPMA抗體檢測試劑盒的研製及其應用[J]．國獸醫科學，2006，36(11)：880-884．
[3] 唐娜．PRRSV診斷方法的建立及魯豫冀地區PRRSV的流行與遺傳變異研究[D]．長春：吉林大學：2013．
[4] YanlongCong, Zhiqiang Huang, Yixue Sun et al. Development and application of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to differentiate antibodies againstlive and inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Virology, 2013, 444: 310-316.
[5] Helena Denac, Christian Moser, Jon DuriTratschinet a. An indirect ELISA for thedetection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen [J]. Journal of Virological Methods, 1997, 65: 169-18.
[6] Yoon IJ, Joo HS, Goyal SM and Molitor TW. A modified serum neutralization test for the detectionof antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 1994, 6(3): 289-292.
[7] 王雲峰，周彥君，仇華吉．應用重組N蛋白-ELISA檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的研究[J]．中國獸醫雜誌，2001，37(3)：3-6．
[8] 王玉娥，楊漢春，郭鑫．用噬菌體隨機膚庫分析豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV-N蛋白單克隆抗體識別的表位[J]. 農業生物技術學報，2004，12(2)：175-178．
[9] 王西西．鑒別PRRS野毒株與TJM-F92疫苗株間接ELISA方法的建立與初步應用[D].北京：中國農業科學院，2016．
[10] 袁寶．豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白原核表達及其抗體檢測方法的建立[D]．長春：吉林大學，2007.
[11] 李素平．PRRSV重組N蛋白ELISA檢測方法的建立及單克隆抗體的製備[D]．鄭州：河南農業大學，2009．