《世界杯賽程預測 導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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真菌毒素免疫檢測技術的研究進展

2017-06-07 15:19:01來源:世界杯賽程預測 導刊

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□ 王文珺 桑華春 北京智雲達科技股份有限公司
真菌毒素的特性及起源
真菌毒素,又稱黴菌毒素,是指黴菌在其所汙染食品中產生的有毒代謝產物,可通過進食進入人或動物體內,引起人或動物的急性或慢性中毒,進而損害機體的肝髒、腎髒、神經組織等。致癌性是真菌毒素對機體最嚴重和最普遍的危害。真菌毒素可在農作物生長或收獲時形成,也會因貯存條件的不適宜而產生。濕度或溫度高的環境通常有利於糧食和飼料中黴菌的生長及其毒素的產生。真菌毒素最早於1960年被發現,當時英國有10萬隻火雞死於該種疾病,後來鴨子也被波及。科學家很快在花生餅飼料中發現了“罪魁禍首”:一種真菌產生的毒素,隨後被命名為“Aflatoxin”。從此以後,科學家投入了大量的時間和精力研究真菌毒素,並發現其主要包括以下幾個特點:
①低分子化合物:真菌毒素都是分子量小於1000的小分子化合物;
②對溫度非常穩定,即使加熱到340℃也不會被分解和破壞;
③抗化學生物製劑及物理的滅活作用;
④具有廣泛的中毒效應;
⑤結構特異性:分子結構不同,毒性差異很大。例如黃曲黴毒素B1是毒性最強的真菌毒素,比砒霜毒性還強,但是僅改變其分子結構中的一個化學鍵,它的毒性就會顯著下降。其實還有一個特點需要特別強調,就是真菌毒素在樣品中的分布是不均勻的,因此分析過程中的取樣方式和取樣量非常重要,往往能夠決定結果誤差的範圍。
目前,己確定的真菌毒素有400多種,常見毒素包括:黃曲黴毒素(AF,包括B1、B2、M1、M2)、玉米赤黴烯酮/醇(ZEN)、赭曲毒素(OTA)、T2毒素、嘔吐毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,DON)、伏馬毒素(FM,包括B1、B2、B3)等。其中黃曲黴毒素B1被認為是毒性最強的真菌毒素,也是糧食和飼料監測的重點。
真菌毒素的危害
據聯合國糧農組織(FAO)統計,每年全世界大約有25%的農產品受到真菌毒素汙染,其中約2%因汙染失去價值,引起的損失達千億美元。飼料及原料(糧食)中的真菌毒素汙染對畜牧業影響巨大,美國因真菌毒素造成的損失達到14.4億美元/年,我國損失則更大,達到150億美元/年。由真菌毒素汙染導致的食品質量安全問題已經引發社會的廣泛關注,真菌毒素是導致糧食和飼料汙染的重要原因,如果動物食用了被真菌毒素汙染的飼料,也可能造成動物源性食品的汙染。例如,奶牛吃了被黃曲黴毒素B1汙染的飼料,它所產的牛奶中就會含有黃曲黴毒素M1。不僅如此,被黃曲黴毒素汙染的飼料還會影響食用動物的健康。仍以奶牛為例,真菌毒素通過改變機體的新陳代謝和行為,導致奶牛產奶量降低,因飼喂受真菌毒素汙染的飼料而造成產奶量減少是奶牛養殖場的常見現象。對奶牛產奶造成不利影響的真菌毒素主要是黃曲黴毒素和不同種類的鐮刀菌毒素。黃曲黴毒素損害奶牛的肝髒組織,破壞肝髒功能,嚴重情況下會導致奶牛死亡。除此之外,黃曲黴毒素對豬的胚胎致死率高,致畸性強,易導致胚胎早期死亡被吸收、流產、弱仔,從而降低繁殖率。
概括來說,真菌毒素的危害性主要具有以下特點:其一為普遍性,即在穀物生產、儲藏、加工階段已經被感染,尤以玉米更為嚴重。二是隱蔽性—感官難以判斷,除非已經發生顏色、氣味等變化,隱蔽性毒素無法用常規物理方法判斷。第三為微量性:低劑量即可導致畜禽或人患病。第四,蓄積性:一些真菌毒素如玉米赤黴烯酮、赭曲黴毒素等不易排出體外,會在體內蓄積達到中毒劑量。最後是協同性,表現為混合汙染,協同作用,加大對人類、畜禽機體和生產性能的危害。
為了消除真菌毒素的危害,目前人們主要從兩個方麵著手:一是建立準確、快速、靈敏、多目標物的檢測技術;二是研究發現真菌毒素的脫毒技術的研究。
國內市場真菌毒素快檢產品現狀
從“十五”起,食品質量安全問題就已引起了國家政府的高度重視,政府的重要工作會議都強調了食品質量安全的重要性。2015年10月1日實施的新《 世界杯賽程預測法》,加大了對食品質量安全的監管力度和懲治力度。同時,新《 世界杯賽程預測法》第一百一十二條規定:縣級以上人民政府食品藥品監督管理部門在世界杯賽程預測 監督管理工作中可以采用國家規定的快速檢測方法對食品進行抽查檢測。對抽查檢測結果表明可能不符合世界杯賽程預測 標準的食品,應當依照本法第八十七條的規定進行檢驗。抽查檢測結果確定有關食品不符合世界杯賽程預測 標準的,可以作為行政處罰的依據。以上,從法律層麵肯定了快檢可以作為一種執法手段,這也就對快檢技術及產品提出了更高的要求。
經過我國政府十餘年的努力,國產食品中的化學汙染和殘留已經得到有效控製,但是真菌毒素汙染問題仍較為突出。真菌毒素對糧食、飼料、奶、肉、蔬菜、水果的危害已經到達令人觸目驚心的程度,對真菌毒素的監測也已經引起國家相關部門的充分重視。在國家糧食局、農業部、國家食藥總局等部門的監控計劃中,都把食品中真菌毒素列為監測重點。2017年3月17日,國家食品藥品監督管理總局發布的《世界杯賽程預測 國家標準食品中真菌毒素的限量》(GB 2761-2017)替代了GB 2761-2011。科技部“十三五”國家科技支撐項目也把真菌毒素檢測及脫毒技術列為資助重點,為控製真菌毒素的社會危害提供技術保障。
目前,國內市場真菌毒素的免疫快檢方法主要包括膠體金檢測卡、酶聯免疫檢測試劑盒和時間分辨熒光免疫檢測卡等,相關的快檢儀器設備有酶標儀、膠體金讀卡儀和時間分辨熒光檢測儀。此外,還包括一些前處理方法和設備,如淨化柱、免疫親和柱等。國內有上百家世界杯賽程預測 快檢公司能生產檢測真菌毒素的快檢產品,但產品質量良莠不齊,高質量的產品相對較少,造成的現實情況是真菌毒素快檢產品在我國市場還無法完全實現本土化。一些權威檢測和監管部門依然比較認同美國羅馬(Romer)公司和Charm公司的產品。一個普遍的觀點是,雖然國外產品價格比國內產品高50%甚至100%,但是其產品質量穩定、準確度高。事實上,國內自主研發的產品在質量上已經有所突破,在一些官方組織的產品比對實驗中,甚至出現國產產品質量超過國外產品的情況,這可以說是國內真菌毒素快檢行業的一大進步。但大的技術方向還是步國外技術的後塵,依然是模仿+超越的模式。其實從樣本適用性和價格的角度講,國內產品應該具有明顯的競爭優勢。這就需要國內的企業在質量上把關,提高核心技術優勢,對真菌毒素的性質、危害及在糧食及飼料中的代謝動力學有充分了解,提早在產品研發上攻關,盡早完成市場培育,推動企業的核心競爭力,實現我國自主研發的產品對國內市場的覆蓋,從而保障我國人民群眾的生命財產安全,實現對糧食、飼料、奶、肉及水果、蔬菜的有效監管,維護我國對外貿易活動的正常進行。
真菌毒素免疫檢測的關鍵技術點
技術創新點
目前,國內市場真菌毒素快檢產品主要是基於抗原、抗體(不排除使用受體和配體)特異性反應的免疫快檢產品。產品研發中的重點和難點問題主要集中在原材料的質量、產品的適用性、產品的性能、重點監測物這4個方麵。
第一,抗原、抗體等原材料的質量。要了解原材料的重要性,需先了解抗體製備流程。真菌毒素屬於小分子物質(分子量<1000),其本身不具有免疫原性,需要與大蛋白偶聯才能對機體產生免疫應答。如何將小分子的物質轉變成免疫原?首先需要合成一個帶有活性基團(一般是-COOH和-NH2)的碳鏈長臂,即半抗原。半抗原位點的選擇與抗體的特異性關係極大,其與大的蛋白結合(比如牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA等)可獲得免疫原和包被原。用免疫原免疫動物待效價和特異性達到要求,取動物抗血清獲得多克隆抗體,如果不采血而是進一步取動物脾髒細胞、融合、克隆、培養上清和打腹水等步驟,將獲得單克隆抗體。免疫動物的類型和免疫方法與抗體的親和力關係較大,抗體的親和性是抗體質量的一個重要參數。本項目研究中包括但不限於以下3點要特別關注—半抗原偶聯的位點、免疫方式、單抗製備過程中的克隆和篩選。
在真菌毒素抗體製備方麵,國內一些高校、科研機構及規模較大的世界杯賽程預測 檢測試劑公司都在開展相關工作,其中不乏一些高特異性(或廣譜性)、高親和性的抗體。而且一些技術申請了國內專利,甚至有些科研機構抗體的製備方法還申請了國外專利,並把抗體賣到了國外多個國家和地區。好的原料來源是優質快檢產品的充分必要條件,而高質量、穩定來源的抗原抗體是目前快檢產品研發公司麵臨的最主要問題之一。抗體的特異性與匹配的抗原關係極大,穩定的抗原製備流程也是必須關注的重點。
第二,快檢產品的適用性。國內真菌毒素快檢產品沒有覆蓋國內市場的原因是產品質量不能完全滿足檢測要求,或者說國外的產品能更好地滿足檢測要求(準確性、便捷性)。比如Charm的膠體金檢測卡,一條C線,兩條T線,能夠通過讀卡儀實現準確定量。而國內膠體金檢查卡,基本以定性檢測為主,隻有極少數廠家推出了膠體金定量檢測產品,並將檢測結果數據化,與世界杯賽程預測 的大數據管理相符合。包括北京智雲達科技股份有限公司在內的少數公司選擇了從另一個技術角度解決檢測卡的定量問題,即時間分辨熒光檢測技術。時間分辨熒光檢測卡,檢測的激發光在300~400nm之間,而發射光在600~650nm之間,受外部幹擾少,所以穩定性較好,可更高效的實現定量檢測。此外,熒光信號比膠體金的可見光信號更強,提高了檢測技術的靈敏度,進而簡化了前處理過程。
第三,產品的性能。在保證靈敏度的前提下,產品的性能涉及到兩方麵內容,即檢測結果的穩定性和準確性。在產品研發過程中,有幾個節點非常重要:第一節點是樣本的選擇,即樣本的適用性。檢測樣本是產品研發過程中必然要進行的一個過程,而且產品的最終驗證也要落實到樣本檢測上。首先,要有通過國標方法確定陰性和陽性的樣本。一些快檢試劑研發公司為了壓縮研發時間,對於樣本不願意進行足夠的投入,把從超市買來的樣本默認為陰性樣本,姑且不說超市的樣本是否真的是陰性樣本,連樣本在存儲過程中真菌毒素的變化情況都有待確證。第二節點是檢測體係的穩定性。國外真菌毒素快檢產品的穩定性優於國內產品,包括檢測結果的穩定性和有效保存期內的穩定性。批間差是現有國內免疫產品尤其是真菌毒素膠體金檢測卡的主要瓶頸,這是產品性能方麵關注的第二個重要方麵。
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