qPCR即實時熒光定量核酸擴增檢測係統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測係統。昆山吉和力儀器有限公司整理了一些關於qPCR的常見問題，並對這些問題一一進行了解答。
昆山吉和力儀器有限公司（以下簡稱“吉和力”）是一家提供專業服務和儀器設備的集成供應商，公司以用戶實際需求為導向，提供最合適、性價比最高的儀器，致力於打造一站式服務平台。為了讓業內人士對qPCR進行更加深入的了解，吉和力整理了一些相關常見問題，並對這些問題一一進行了解答。
qPCR的英文全稱是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即實時熒光定量核酸擴增檢測係統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測係統，簡稱qPCR。
簡單來說，qPCR就是利用熒光信號的變化，實時監測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。而常規的PCR無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時監測。
如何提高RT-PCR反應的靈敏度與特異性？
①確定模板RNA完整性，無DNA汙染；
②RNA模板中不應含有擴增反應抑製劑；
③為了防止模板降解，在反應體係中加入RNase抑製劑RNasin；
④使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱；
⑤若模板中有二級結構，可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果；
⑥設計引物時，避免在引物3’端含有互補序列，避免形成內部發卡結構。
避免RNA降解的方法有哪些？
①在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA；
②運用良好無汙染技術分離RNA；
③將組織從動物體取出後立刻提取RNA，並將提取好的RNA反轉錄為cDNA進行低溫保存。
RNA中含有逆轉錄抑製劑時，怎麼處理？
逆轉錄抑製劑包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽，可將對照RNA與樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢測RNA抑製劑；若對照RNA與樣品混合後產量降低，則說明樣品中存在逆轉錄抑製劑，可用70%（v/v）乙醇對RNA沉澱進行清洗，以除去抑製劑。
如何減少RNA模板中的二級結構？
①將RNA和引物在不含鹽及緩衝液條件下變性、退火，提高逆轉錄反應溫度；
②溫度超過60℃時，不能使用oligo（dT）引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP；
③RT-PCR產物的長度超過1kb時，反應溫度需保持在65℃。
RNA中有DNA汙染的處理方式
①若是基因組DNA的汙染，可使用DNaseI處理RNA，同時設置沒有逆轉錄對照組反應檢測DNA汙染；
②若是受到外源DNA的汙染，可使用抗氣霧劑和UDG酶。
qPCR探針設計的一般原則有哪些？
①擴增片段的長度不應太大，一般小於300bp；
②探針不能和任一引物互補，且其長度在保證特異性的前提下盡可能的短，長度不要超過30bp；
②探針的Tm值至少比引物的Tm值高5度；
③探針如用於檢測多態位點，多態位點應盡可能靠近探針中部；
④探針5’端不能是堿基G，G對熒光基團有猝滅作用。
無反轉錄酶情況下，對照RNA仍有擴增結果
①體外轉錄時不可能將所有DNA模板消除，因而對照組會含有痕量的DNA。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA汙染造成的影響；
②可能是引物二聚體的條帶。
擴增產物滯留在加樣孔中
①可能是由於模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物，建議將第一鏈cDNA濃度稀釋至100倍再進行二次擴增；
②在二次PCR時，使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。
無Ct信號出現
①反應循環參數不夠，一般要在35個循環以上，但是過多的循環次數可增加背景值；
②檢測熒光信號的步驟有誤。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸時采集熒光信號，taqman法則是在退火結束或延伸結束時進行信號采集；
③引物或探針降解，可用PAGE電泳檢測其完整性，若是電泳條帶呈彌散狀，可考慮重新合成引物或探針；
④模板不足或降解，則可以重新提取核酸模板。
Ct值出現過晚（Ct>38）
①擴增效率低，反應條件不夠優化，降低退火溫度，增加鎂離子濃度；
②反應成分降解或加樣量不足；
③PCR產物過長，一般采用80-150bp。
標準曲線線性關係不佳
①加樣存在誤差，是樣品濃度不成梯度；
②標準品出現降解，避免反複凍融；
③引物或者探針設計不佳；
④模板中存在抑製物或模板濃度過高。
溶解曲線存在多個主峰
①引物設計不夠優化；
②引物濃度不佳，上下遊引物濃度比例不一致；
③鎂離子濃度過高；
④模板基因組的汙染。
同一樣品中，其中某一個熒光信號特別強
①試劑配製時反應液沒有完全溶化，導致探針量在一管增多；
②試劑配製時沒有充分混勻致各管中各成分的量不同；
③PCR儀熱槽被熒光物質汙染，需要清除熱槽中的汙染。
擴增曲線有一向上或向下的尖峰？
①反應過程中電壓不穩定；
②可能在20個循環左右時，儀器有停下或儀器有開蓋，使光線突然增強；
③如果尖峰向下，可能是由鹵素燈老化所致，這時應更換。
部分樣本擴增效率過低？
①提取液殘留，一定程度抑製了PCR反應；
②反應液未嚴格取量混勻或分裝不均勻；
③試劑失效。
陰性對照或空白對照翹尾
①模板提取環境或操作過程有汙染；
②配液過程存在汙染。
直線型擴增曲線
①探針部分降解：一般稀釋的探針可在4℃保存至少3個月，探針的反複凍融或導致降解；或者探針在光線下暴露時間太長了；
②反應液中有PCR抑製物。
沒有擴增曲線
①PCR參數設置錯誤，在設計循環參數時將熒光信號讀取時間設在反應的第一步，即stage1階段；
②電腦設定了自動休眠。
基線下滑
基線選取範圍不對，可試著將基線範圍改大一些，這一問題常因試劑質量所致。
擴增曲線斷裂
基線選取範圍不對，基線終點大於Ct值，這通常是由於模板DNA濃度過高所致，因Ct值<15，而基線範圍仍取3~15，其中包含部分擴增信號，導致標準差偏大，閾值過高，解決辦法：減少基線終點至Ct前4個循環，重新分析數據。
樣品濃度跨度過大
樣品濃度過高，導致陽性樣品擴增曲線在後麵循環中呈一向下的直線，其解決方法同“擴增曲線斷裂”。
山坡形曲線
常因反應管封口不嚴，至反應液蒸發所致。