自然界中廣泛存在著各種微生物，這些微生物在食品生產各個環節中都可能會對食品造成汙染。陶老師是微生物控製領域具有深厚影響力的學者，為了更加深入的了解微生物快速檢測方法，陶老師整理了關於食品中的微生物快速檢測的一些問題，並就這些問題一一作出了解答。
1 如何定義食品中微生物快速檢測方法？
食品快速檢測的廣泛定義是簡單、快速、準確的分析方法，能夠對處理好的樣品在很短的時間內檢測出結果。如今，大部分理化項目快速檢測方法可以實現在幾小時甚至幾分鍾內檢測出結果。
快速檢測方法具有如下一個或者幾個特點：
（1）檢測時間比標準方法短；
（2）操作簡單，流程簡單，判斷明確；
（3）靈敏度高，結果準確；
（4）實現自動化。
但是，對於食品中微生物檢測而言，必須經曆培養、增菌等階段，無法實現在1~2個小時內出結果。
2 食品中微生物快速檢測方法具備的特點？
食品中微生物快速檢測方法具有如下一個或者幾個特點：
（1）操作簡便，檢測速度快，檢測時間短；
（2）靈敏度高、特異性強，檢測結果更為精確；
（3）自動化程度高，減少人為參與，降低人工成本；
（4）對檢驗人員經驗依賴程度低，操作簡單，易於標準化；
（5）產品更小、更輕、更便攜，更適合現場檢測。
3 目前常用的食品微生物快速檢測方法有哪些？
常用的食品微生物快速檢測技術從大類上主要有：傳統計數改良方法，免疫學方法，分子生物學方法。
（1）傳統計數改良方法是在傳統培養方法基礎上進行改良的計數方法，克服傳統方法培養時間長、操作繁瑣、誤差大等缺點，包括培養基改良法、濾膜法、紙片法。
（2）免疫方法是以抗原抗體的特異反應為基礎，利用不同微生物特異抗原激發機體產生特異抗體，從其特異性檢測相應的致病微生物。常用的免疫學方法有酶聯免疫吸附技術、免疫膠體金技術、上轉發光技術、免疫磁珠分離技術和乳膠凝集法等。
（3）分子生物學方法，其中PCR技術是應用最廣的分子生物學方法，主要應用為普通PCR，熒光定量PCR和等溫擴增等。
除以上常見快檢方法外，近些年發展的飛行時間質譜、微流控技術、流式細胞技術、新一代測序技術等新興技術也正在或將要應用於食源性致病微生物的快速檢測。
4 幾種食品微生物快速檢測方法的差異主要有哪些？
改良的計數方法，克服傳統方法培養時間長、操作繁瑣、誤差大等缺點，操作接近國標方法，目前使用最廣泛，可定量，可定性。免疫學方法優勢是特異性高，操作時間短、檢測結果可靠，適合批量檢測和自動化檢測（VIDAS），劣勢是高質量抗體獲得困難、產品開發周期長、檢測靈敏度受靶標蛋白的影響大。分子學方法優勢是靶標明確，操作時間短、檢測結果可靠，但核酸提取效率和係統穩定性是一大挑戰。
5 如何評價一個食品微生物快速檢測體係？
食品中的微生物尤其是致病菌具有檢出率高但是含量低的特點，故檢測方法的靈敏度和限量要求之間有著很大的差異。因此，一個好的檢測係統應該包括一個好的增菌培養方法和一個好的檢測方法，二者要綜合起來一起評價。一個好的增菌培養方法要滿足以下條件：微生物的複蘇能力要強，生長速度要快，選擇性要好，產量要高；而一個好的檢測方法需要具備速度快、準確度高，結果準確明晰等特點。
6 目前有國家標準的食品微生物快速檢測方法有哪些？
從GB 4789中可以看出，顯色培養基、微生物鑒定係統已被廣泛應用，沙門氏菌、單增李斯特菌、阪崎腸杆菌、副溶血弧菌可采用全自動微生物檢測鑒定係統，除此之外，還有以下方法也被國標應用：
（1）GB 4789.6-2016食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗中提到，取生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落進行PCR確認試驗。
（2）GB 4789.10-2016食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗中關於金葡腸毒素檢測，可用A、B、C、D、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型酶聯免疫吸附試劑盒完成。
（3）GB 4789.12-2016食品微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗毒素基因檢測采用PCR進行擴增和檢測。
（4）GB 4789.36-2016食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗，可用免疫磁珠捕獲法檢測，此外，毒力基因檢測采用PCR進行擴增和檢測。
（5）GB 4789.42-2016食品微生物學檢驗諾如病毒檢驗采用實時熒光RT－PCR方法進行檢測。
（6）GB 14934-2016 世界杯賽程預測國家標準消毒餐（飲）具可采用餐具大腸菌群紙片法進行檢測。
7 國外微生物快速檢測方法的應用情況如何？
目前，就技術應用而言，歐盟使用傳統方法和快速方法的比例各占50%；美國主要以快速方法(包括基於免疫學技術的側向層析試紙和ELISA試劑盒)和分子生物學方法(如PCR)為主，我國仍沿用傳統培養方法，這已經難以滿足 世界杯賽程預測監管及企業/行業對檢驗時效性的需求。
8 目前大部分快速檢測方法沒有標準，企業可以用嗎？
國家標準方法是不可替代的，在產品出廠檢測、政府執法、第三方出具報告等方麵必須采用國家標準方法進行檢測。目前微生物的國標檢測方法普遍為培養法，因此在談到微生物檢測的國標時，通常指的是培養法，但是隨著技術的進步，越來越多的新技術及其方法將進入國家標準。
在企業質量內控，如：原輔料檢測、生產環境監測、過程產品監測等歡迎都可以采用快速檢測方法，但前提是，所選的方法／產品，實驗室必須要跟國標進行比對，對準確性和穩定性就行測試後方可采用。
9 企業如何選擇適合自己的微生物快速檢測方法？
沒有最好的方法，隻有最適合的方法，企業在選擇快速檢測方法時要從產品、檢測項目、檢測量、預算等多個方麵進行考慮。選擇快速檢測產品時，要從產品的準確度、穩定性、操作便捷、成本等方麵考慮。
（1）檢測樣品決定選用方法。檢測方法均具有一定的適用範圍，例如，諾如病毒的ELISA試劑盒適用範圍為糞便，如果製定為檢測蔬菜的行標就不合適；在沙門氏菌檢驗中低菌量樣品可以一步增菌。
（2）檢測項目決定選用方法。例如：定量檢測的項目，采用測試片、顯色培養基等方麵；致瀉性大腸杆菌，采用PCR方法檢驗；金葡腸毒素，采用免疫方法檢測。
（3）樣品數量。樣品數量大、建議采用免疫學方法,例如ELISA。
（4）實驗室預算。預算少，可以采用不需要儀器紙片法、免疫學方法，預算多，可選用全自動微生物檢測鑒定儀、PCR等。
10 企業如何通過實驗判定某個微生物快速檢測產品是否符合需求？
首先，判定標準要從準確度、穩定性、操作是否方便等方麵進行測試。其次，實驗又分定量實驗和定性試驗兩種。定量實驗，跟國標方法比對準確率和使用便捷性，設計標準菌實驗和樣品實驗，進行計數比對，交叉反應比對，判定生長率、特異性及穩定性。定性試驗，主要是致病菌檢測，比度假陽性／陰性率及使用便捷性，設計標準菌實驗和樣品添加實驗，來判斷產品的穩定性和準確性。此外，從驗證頻率上，建議每半年進行一次比對驗證，確定產品的穩定性；同時，建議同類產品選擇兩個以上品牌產品進行使用。
11 熒光定量PCR、等溫PCR、普通PCR的區別？
實時熒光RT－PCR是在PCR反應體係中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現實時監測整個PCR進程，並對起始模板進行定量分析的方法。普通PCR是借助DNA電泳對擴增反應的終產物進行半定量及定性分析。等溫PCR又稱環介導等溫擴增技術能在等溫（60~65℃）條件下，短時間（通常是一小時內）內進行核酸擴增，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴增方法（具體區別見表1）。 12 食品中致病菌快速檢測是否需要前增菌？是否必須增菌？
食品中致病菌檢測是否需要增菌要從檢測要求來看，定量檢測的如金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌等，可以均質後直接進行檢測。對於不得檢出的致病菌必須進行增菌。國標對 食品檢測樣本的要求：1CFU/25g，25g樣品中不允許1CFU，樣品前處理後，1CFU/25g+ 225mL，培養基=0.004CFU/mL。再看幾種檢測方法的靈敏度：培養方法靈敏度均在103以上，免疫方法靈敏度均在105以上，PCR方法靈敏度也要求在102以上。食品樣本相對很幹淨，不增菌，是無法到達檢測靈敏度的。
13 目前提高食品中致病菌增菌效率的方法有哪些？
增菌是檢測的前提，增菌效果如何，關係到靈敏度，對檢測至關重要。如國標方法，沙門氏菌增菌需要至少兩天的時間，增菌時間長，主要是菌體的複蘇、生長和選擇性的問題。目前主要的增菌富集技術有：
（1）改良培養基成分和增菌方式，通過改良培養基的成分和培養溫度，讓菌體可以快速複式、生長，提高選擇性，可以在24小時之內完成兩步增菌。
（2）免疫磁珠富集，磁珠上的抗體與相應的目標致病菌的抗原物質結合後，則形成抗原-抗體-磁珠免疫複合物，使複合物與其他物質分離，而達到分離、濃縮、純化目標致病菌的目的。
（3）噬菌體技術，利用噬菌體的專一性，通過噬菌體裂解殺死幹擾菌，從而是目標菌株實現快速的增殖。例如，在沙門氏菌的增菌過程中，通過噬菌體特異性的裂解幹擾的大腸杆菌，從而實現沙門氏菌的快速、高濃度增殖。
（4）膜過濾和層析技術，過濾法富集微生物是將適當孔徑的濾膜放入濾器，過濾樣品。由於濾膜的作用而將微生物滯留在膜表麵，使微生物與樣品溶液分開，達到微生物富集目的。