硝基呋喃類藥物是一類人工合成的抗生素,主要包括呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃它酮(furaltadone)、呋喃西林(furacillin)和呋喃妥因(nitrofurantion)等，是治療畜禽胃腸道疾病的藥物或作為飼料添加劑，廣泛應用於臨床和動物養殖業。動物大劑量或長期使用硝基呋喃類藥物會引起中毒性反應，出現厭食、腹瀉、胃腸出血、周圍神經炎等症狀，甚至引發死亡。當硝基呋喃類藥物及其代謝產物通過動物性食品被人體吸收後，能在體內蓄積，導致慢性中毒，甚至致癌、致畸、致突變。由於硝基呋喃類抗生素的代謝物在動物組織中殘留時間較久且不易降解，所以對硝基呋喃類藥物殘留的檢測一般通過檢測其代謝物來實現。
國內外都對呋喃類物質采取了嚴格的控製手段，對其測定標準都有明確規定。2003年歐盟(EU)通過了2003/181/EC委員會決議，規定用於禽肉產品和水產品中硝基呋喃類藥物代謝物的最小要求性能限值(Minimum Required Performance Limits，MRPL)為1μg/L。2002年，我國農業部發布的第235號公告中說明在動物性食品中不得檢出稍基呋喃類藥物，並在飼養過程中禁止使用此藥物。2010年，衛生部將硝基呋喃類藥物列入《食品中可能違法添加的非食用物質名單》。
目前，硝基呋喃類藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜一質譜法(LC-MS)、液相色譜一串聯質譜法(LC-MS/MS)等儀器方法及免疫檢測法(Immunoassay，IA)。隨著我國對 世界杯賽程預測日益重視，檢測樣品量與日俱增，儀器分析方法因過程複雜，耗時長而無法滿足大批量、快速、及時、現場檢測的需要。因此，開發出簡潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類藥物殘留快速檢測方法已成為保障 世界杯賽程預測的關鍵。
酶聯免疫分析法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay, ELISA)已成為近年來發展較快的免疫分析技術。其基於抗原抗體反應和酶化學反應原理，可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析，特異性強、靈敏度高、重複性好、操作簡單，正逐步應用於多種藥物的殘留檢測，成為當前應用最廣、發展最快的一項微量測定技術。本文主要分析酶聯免疫分析法在呋喃類藥物殘留中的應用。
材料與方法
實驗材料包括雞肉、魚肉，樣本均為市售產品；試劑包括乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、硫酸鋅、磷酸氫二鉀等試劑（上海華美公司）。儀器包括酶標儀（美國Thermo公司）、分析天平（賽多利斯科學儀器公司）、均質器（莆田市南榮貿易有限公司）、溫箱（天津市中環實驗電爐有限公司）、氮吹儀（美國Organomation公司）、離心機（上海安亭科學儀器廠）、微量移液器（美國Thermo公司）等。
樣品前處理過程：取1g均質的樣品於50mL離心管中，依次加入4mL去離子水、0.5mL 1M HCl和80μL 50mM鄰硝基苯甲醛，渦動1min至組織充分分散。衍生化16h（37℃溫箱孵育16h）後，依次加入5mL緩衝溶液、400μL 1M NaOH和6mL乙酸乙酯，劇烈渦動1min、4000g以上離心10min。取3mL上清液於新的離心管中，50~60℃水浴中，氮氣吹幹，加入1mL正己烷，再加入1mL樣品稀釋液，高速渦動30s，離心5min，吸取下層清液500μL於幹淨離心管中，並取50μL進行檢測。
ELISA標準曲線建立：取6個濃度（0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81μg/L）呋喃唑酮代謝物標準品，用每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值（B）除以第一個標準品溶液（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100％，得到百分吸光度值。對數據結果進行分析，以標準品濃度（μg/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸擬合出標準曲線，計算半抑製濃度（IC50）。
樣本測定檢測操作步驟：將50μL各標準品工作液和樣品溶液分別加入對應的樣品孔中，依次加入50μL酶標記物工作液、50μL的抗體工作液；蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下避光反應30min。倒掉板孔中液體，加入260μL洗滌工作液，充分洗滌，加入底物混合液。避光反應後，加入50μL終止液，輕輕振蕩、混勻。用酶標儀在雙波長450nm、630nm下檢測吸光度。
對性能的分析：為了證明酶聯免疫試劑盒對呋喃類藥物殘留的檢測性能，對試劑盒的靈敏度、最低檢測限、準確度、精密度進行統計計算。同時，為了證明所用試劑盒的穩定性和準確性，分別對10份雞肉和魚肉盲樣進行測定，與儀器分析方法結果進行對比。儀器方法采用GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜一串聯質譜法》中所述的檢測方法進行操作。
結果分析
標準曲線的建立：
以呋喃唑酮代謝物為例，利用維德維康數據分析軟件建立ELISA標準曲線（見圖1），標準曲線信息見表1，IC50=0.035μg/L，相關係數r=0.9978，線性範圍為：0~0.810μg/L，結果表明呋喃唑酮代謝物在0.01~0.810μg/L的濃度範圍內有良好的線性。 最低檢測限的確定：樣品的最低檢測限是靈敏度的一個評價指標。在本實驗中，分別測定了20個空白雞肉、魚肉等樣品，根據樣本檢測線（LOD）=20份空白樣本（平均值±標準差）+3倍標準偏差（SD），可以確定各樣本的檢測限，結果由表2~表6所示。結果表明，本試劑盒雞肉檢測限為0.098μg/L，魚肉檢測限為0.095μg/L。




準確度和精密度的確定：準確度是指測定值與真實值的符合程度，在ELISA測定中，準確度常以回收率表示，精密度常以變異係數來表示。在本實驗中，取空白樣品，將雞肉、魚肉依次按1倍檢測限和2倍檢測限濃度呋喃唑酮代謝物標準品進行添加，每個添加5個平行。用3個批次的試劑盒測定，計算添加回收率及板內板間變異係數，結果見表4~表5。經計算得，雞肉樣品各添加濃度的回收率在87%~99.5%之間；魚肉樣品各添加濃度的回收率均在88%~100%之間。呋喃唑酮代謝物在所有樣品中各添加濃度的板內變異係數均低於5%，板間變異係數均低於10%。
與儀器方法比較：用酶聯免疫檢測法和儀器法分別對10份雞肉、魚肉盲樣進行測定，比較測定結果，以儀器方法檢測限作為陰陽性判定值，小於儀器檢測限試劑盒檢測結果記為“－”，儀器結果記為“ND”，大於儀器檢測限以實際檢測值表示。結果見表6~表7。結果顯示，二者的符合率為100%。


討論
本文以雞肉和魚肉的呋喃唑酮代謝物檢測為例，分析了ELISA法在肉及肉製品中硝基呋喃類藥物快速檢測的可行性。結果表明，維德維康生物技術有限公司研製的呋喃唑酮代謝物酶聯免疫試劑盒具有較低的檢測限、較高的靈敏度和準確度，並且與儀器分析方法結果一致，說明ELISA試劑盒能夠實現硝基呋喃類藥物殘留的準確檢測。同時，ELISA試劑盒實驗操作簡單，有效地縮減了檢測時間，提高檢測效率的同時降低了檢測成本。
雖然具有潛在“三致”作用的硝基呋喃類抗菌素在國內外已禁用了二十餘年，但時至今日硝基呋喃類抗菌素及其代謝物 殘留仍時有檢出。因此，開發出簡潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類藥物殘留快速檢測方法已成為保障世界杯賽程預測 的關鍵，而ELISA試劑盒的強特異性、及時性、低成本能夠有效地填補硝基呋喃類藥物殘留快速檢測的空白，有力地推動我國世界杯賽程預測 快速檢測技術的發展。