黃曲黴毒素是一種二氫呋喃香豆素的衍生物。它的致癌性和對DNA的破壞性是經過驗證而被全球醫學界普遍認同的。黃曲黴毒素的毒性非常大，其毒性比氰化鉀還要大十倍，動物中得急性肝炎、出血性壞死和膽管增生等疾病均是由此類毒素所致，對動物的健康有著較壞的影響。黃曲黴和寄生曲黴的代謝產生了黃曲黴毒素。另外，人們日常使用的穀物中，由於沒有及時的晾曬導致穀物發黴也會產生黃曲黴和寄生曲黴，從而也會產生黃曲黴毒素。黃曲黴毒素對人類食物的汙染是黃曲黴毒素對人體產生危害的主要禍源。黃曲黴毒素在我們日常食物中普遍超標存在，盡管一些國家為此製定了一係列嚴格的相關規定，但是由於其存在廣泛且有些食物中含量較低，因此對含有此類毒素的食物並不能得到完全的防控，需要特別指出的是發展中國家因為黃曲黴毒素而汙染的食物與人口中患癌數量成正相關性關係。不僅如此，黃曲黴毒素也同時會誘發人體其他疾病的病變，且存在疊加效應，因此，黃曲黴毒素對人體產生的危害具有嚴重性和深遠性。目前，黃曲黴毒素已經分離出十二種分毒素，其中，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物。前者為基本毒性結構後者與致癌有關。B1在動物體內經過羥化作用產生了代謝物M1。其中M1和M2 主要存在於牛乳中。B1為毒性及致癌性最強的物質。黃曲黴毒素的化學分子量為312-346，其外表形態呈無色結晶體形態，具有抗高溫等物理性質，但是該毒素對紫外線免疫力較低;該毒素能夠較容易溶於有機物中，例如油類和甲醇丙酮等，但是不溶於水等無機物中。此外該毒素也不溶於乙醚和石油醚等物質。在中性溶液中表現較穩定，但在強酸性溶液中會分解迅速。

　　黃曲黴毒素M1的檢測方法較多，各種方法得到效果大致相同，但是從成本、複雜度等方麵綜合考慮後，國際上目前采用較多的方法有：免疫化學法、色譜法、電化學及化學發光法等方法。其中在色譜法中，高效液相色譜法可以較為快速準確的檢測食物中黃曲黴毒素M1的含量，因此，該方法在眾多檢驗機構和食品企業中使用率較高。它的特點是能夠大大降低實驗過程中對操作者產生的危害。試驗部分試驗中所采用的檢測設備及儀器分述如下：提取溶劑采用乙腈/水，檢測儀器為免疫親和柱淨化，光化學衍生熒光檢測器，該檢測器的優點是能夠同時測定乳製品中黃曲黴毒素M1和M2的含量。試劑與樣品,試驗中使用的黃曲黴毒素M1標準品：采用Sigma公司的毒素製品(46319-U)：10μg/mL)，黃曲黴毒素M1的免疫親和柱采用國內生物科技公司產品。Merck公司生產的乙腈和甲醇試劑;國藥集團生產的：磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鉀和氯化鈉作為分析純;Millipore產的超純水儀提供試驗用水;PBS的緩衝液按1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸氫二鉀、8g氯化鈉、0.2g氯化鉀比例進行調製，用水將其定容到1升，並將PH值調製到7.4。乳製品來自全國各地隨機抽取得到並處於溫度為4的環境中保存。

　　試驗采用的超高效液相色譜儀配熒光檢測器，貝克曼64AR型離心機，步琪R-205型旋轉蒸發儀器，Organomation N-EVAP112型氮吹儀和Gilson Aspec GX-274型自動固相萃取裝置等均采自美國生物設備製造公司。配製標準儲備液和流動相,配製黃曲黴毒素M1標準儲備液,將適量的黃曲黴毒素M1標準樣品提取並存放至5ml棕色試驗瓶中後用乙睛將其定容到10ppb中間儲備液，吸取少量配備好的10ppb的黃曲黴毒素M1放置在提前準備好的容量瓶中;配備1%的乙酸水溶液並定容，並得到含量為1ppb的黃曲黴毒素M1的儲備液，將其保存在避光低溫環境下，同時保持密封。標準曲線的配製

　　將M1黃曲黴毒素用上述配製好的乙酸水溶液進行稀釋後得到含量為1ppb的儲備液，將其配入到五個5ml牛奶液體樣品中，得到含量為20、50、100、200、500ppt的基質加標標準曲線。配製流動相,水相為64%的去離子水;按乙睛18%/甲醇18%標準配製有機相，用0.22μm濾膜對配製好的流動相進行過濾，每日對流動相進行更新。水相應在經過10分鍾的超聲脫氣後使用。主要檢測儀器條件,在UPLC-FLR係統中，保證溫度控製在30度，流速為30μl/min，流動相為64:18:18水/甲醇/乙睛;進樣量為20μl，運行時間定為5分鍾，弱洗針液和強洗針液分別為3：1：1水/甲醇/乙睛和5：1：1乙睛/異丙醇/水，365nm的激發波長，429nm的發射波長。分離提取M1族黃曲黴毒素,在50ml的離心管中放入10g乳液樣品並加入25ml的乙腈，將其配置好後旋轉3min，並進行超聲提取10min和8000r/min離心5min得到上清液，提取上清液並將其進行旋蒸，當旋蒸到液體剩餘10mL後，將其放入50ml容量瓶，加以PBS定容。M1黃曲黴毒素免疫親和柱需要25ml溶液過濾清洗，並用10mi的PBS對柱子進行淋洗。去除全部的流出液體，隨後用5ml甲醇洗脫免疫親和柱對剩餘的洗脫液進行收集並放置在指定容器中;對容器用氮氣吹幹，再用乙腈/水溶液把容器中殘留物質進行溶解，最後將過濾後的液體再次用0.22μm濾膜進行過濾，並裝入收集瓶中保存為隨後使用。

　　試驗結果及討論

　　UPLC-FLR係統中的色譜柱的參數和試驗效果同其他柱子有著明顯的差別，其主要體現在該色譜柱填料粒的直徑較小、柱子的體積較小、出峰時間快。因此在具體的使用過程中，溶劑中的有機相和水相的配比要求較為嚴格，以此保證有機相和水相配製比例與初始的流動相保持相似。隻有這樣得到的色譜峰值圖示才有試驗意義。M1黃曲黴毒素的保留產生的影響源於色譜柱的影響因素。峰值較強的位置出現在甲醇/乙睛2:3階段。該情況經分析後可知：色譜柱中含有少量的連接單克隆抗體的懸浮物質，除此之外，黃曲黴毒素抗體對毒素具有吸附能力，因此，采用配比為甲醇/乙睛2:3作為洗脫液得到的效果會更好，不僅如此，M1黃曲黴毒素還可以被徹底的洗掉，保證數據的準確性。綜上所述，試驗經過驗證後采用甲醇/乙睛2:3另加入50%的去離子水作為溶樣溶液。在試驗階段中，M1黃曲黴毒素的吸附作用較強，使用常規方法會嚴重影響試驗效果，因此在實驗中需要使用免疫親和柱。但是其使用成本很高，所以需要對柱子的使用進行優化，以期能夠在高效使用的前提下降低成本，從而實現大批量快速且有效的檢測。由上述因素可知，黃曲黴毒素具有吸附的特性，且柱體的容量較小。采用每次進樣10ml過濾離心後的樣品分五次加入免疫親和柱過濾。這要可以保證過柱的時間得到明顯的縮短，且堵塞的幾率得到大幅降低。根據免疫親和柱使用規定，柱子隻能使用一次，由於其成本較高，所以對溶液進行優化很有必要。經過檢測後發現，用過的柱子用高度甲醇多次清洗後並用PBS溶液對其進行潤洗後的回收率並沒有出現明顯的下降，也沒有發現存在其他未知幹擾。由此可知該優化方案沒有對試驗產生影響。波長選擇,通過之前的試驗檢驗，M1黃曲黴素的描述參數中激發和發射波長分別定為360nm、420nm的到數據符合預期，數據較為理想，因此對其參數進行采用。線性關係,本次試驗通過配製基質加標標準曲線來校正樣品處理過程中由於儀器所引起的誤差，經過檢測後得到其線性關係良好。經過對M1黃曲黴毒素分別在50、100、200ppb下測定回收率和精密度，結果表明黃Ml曲黴毒素回收率為86.48%-95.78%，RSD小於10%，達到精度要求。回收率試驗將從市場上采集到的乳液及乳粉樣品中的黃曲黴毒素M1進行加標回收率試驗，得到的數據如下表1所示：

表：乳製樣品分析結果及精密度（n=6）

　　超高效液相色譜檢測不僅能夠在短時間對樣品進行檢測，在檢測質量上也具有明顯的優勢，盡管如此，其使用成本對我國來看仍然偏高，本文也在保證試驗質量的前提下對試驗工作中進行了適量的優化，降低了檢測成本，值得推廣。

　　範麗華 貝因美嬰童食品股份有限公司

　　方富良 鄭杭娣 李華 杭州貝因美母嬰營養品有限公司