李新傑 淄博高青縣食品藥品監督管理局

　　我國冷卻肉的消費現狀發展趨勢

　　目前，發達國家生肉供應中的80%是冷卻分割肉，而在我國基本上是低附加值的冷凍肉，分割肉不足 20% 。但是，隨著經濟的快速發展，人們越來越多的吃冷卻肉，而吃凍肉的人群越來越少，由此可以看出我國冷卻牛肉市場仍有很大的發展空間。諸多因素表明，我國消費市場將迎來冷卻牛肉產量的增加和牛肉消費熱潮的到來。目前，我國肉牛屠宰加工業已逐漸由小型、個體性屠宰發展為規模化、養殖機械化、屠宰精細化、分割冷鏈流通連鎖銷售的現代肉品生產經營模式，部分大型企業引進了國外先進的畜禽屠宰分割生產線，在引進和消化國外先進技術的基礎上屠宰工藝技術水平得到迅速提升。

　　我國冷卻肉產業存在的問題

　　隨著冷卻肉替代凍肉，伴隨著冷卻肉產生的問題也越來越多。我國從事畜禽屠宰的加工人員絕大多數沒有經過正規的專業技能培訓，從事肉品檢驗檢疫的人員大多數沒有經過正規的專業培訓，在屠宰車間具有正規衛生檢驗專業人員資格的更是鳳毛麟角。冷卻牛肉作為牛肉的主要消費形態，代表生鮮牛肉生產和消費的發展方向，但是在肉牛屠宰及冷卻牛肉生產、運輸、貯藏和銷售過程中，微生物汙染狀況是整個屠宰過程中微生物汙染的主要來源，會影響到胴體表麵的微生物數量，進而影響到終產品的品質。同時，我國加工冷卻牛肉的企業在工廠中加工的各個工序環節沒有嚴格的衛生標準，加工環境堪憂，極大的製約了我國冷卻牛肉產業的國際競爭力。這是由於屠宰及加工各個環節的微生物汙染差異，可能導致E. coli O157:H7的流行，影響到最終產品的微生物初始量和菌群多樣性，從而進一步顯著影響到真空包裝冷卻牛肉的安全性，並且國內針對微生物汙染研究較少，幾乎沒有研究加工過程中E. coli O157:H7對肉製品的影響。因此，隻有從屠宰、加工的工序上研究微生物對於肉品的汙染，並予以針對性的控製，才能從最健康的角度、從根本上解決我國真空包裝冷卻牛肉食用安全的問題，保障肉牛產業的健康發展。

　　肉牛屠宰的屠宰要點

　　活牛驗收→宰前管理→擊暈、放血→上掛→去頭、蹄、皮→開胸→去內髒→胴體劈半→宰後檢驗→修整→衝洗→冷卻、成熟→分割→包裝、貼標簽→金屬探測→最終產品冷(凍)藏→銷售.工藝要點:去皮 預剝皮，包紮肛門。在四肢裸關節的位置，將皮張行圓周切開，用挑刀的方式，後肢沿跟腱線向肛門的方向挑開，前肢沿側腋窩線的方向劍突上30cm至40cm的位置挑開。在肛門與盆骨腔外口的連接處，沿盆骨腔的外邊緣行圓周切開，用力拉出肛門，將直腸與盆骨腔的剩餘連接部分全部切開，使肛門整體脫離屠體以能拉出20cm至25cm為準，將肛門結紮環套在肛門結紮鉗上，是氣動開關使之擴到最大位置，套入用塑料袋包好的肛門，結紮在離肛門頭15cm到20cm的位置。去內髒 在後腹會陰位置開一個能用手放進腹腔內的孔，用正握反刀的方式伸進腹腔內，刀刃正對腹白線的位置，向下用刀將腹腔全部切開至胸膛鋸開處。衝洗 衝洗在胴體冷卻前實施，即采用高壓常溫水、熱水或有機酸衝洗、噴淋或蒸汽噴淋等技術，采用這些措施清楚可視物(如牛毛、糞便等)，有效減少胴體表麵的微生物汙染。相對與國外企業普遍應用多種胴體衝洗噴淋減菌技術，國內的肉牛屠宰企業常用的僅有清水衝洗方法，且多數為人工噴洗。隻有極個別的企業配備有高壓清水清洗、熱水巴士殺菌噴淋、有機酸噴淋等設備。冷卻 胴體冷卻是指采用一定的冷卻程序(溫度、濕度或外加冷卻物質)降低宰後胴體溫度，排除胴體內部熱量的過程。其目的在於保證肉品安全、最大限度地延長產品的保質期，降低導致最終產品品質劣化的胴體變化，盡可能快的降低胴體的溫度，抑製微生物的生長並減緩肌肉蛋白質的變性。分割 胴體分割主要指將牛半胴體根據市場需要分割成不同的部位。將半胴體推出排酸庫並對其進行四分體處理，每切割一塊半胴體，切割鋸消毒一次，及時清理鋸掉的肉、油、骨、骨末，放入廢棄物盛裝桶內，妥善處理。然後進入分割間進行不同部位分割並修正，除去碎骨、結締組織、淋巴、淤血及其他雜質。大腸杆菌的易感環節 ,在動物皮膚、消化道,呼吸道是一個病原微生物擴散的重要來源。動物的消化道,呼吸道在屠宰過程中會導致病原微生物的擴散。肉牛屠宰線,直接接觸被宰殺的動物可以很容易地被由動物病原微生物汙染,並逐漸成為致病細菌的媒體和動物屍體屠宰後的傳播甚至成為病原體汙染的來源。在微生物汙染的方方麵麵，屠宰、切割、加工、存儲和分布的肉。在宰前檢驗過程中,動物皮毛是交叉汙染的一個重要媒介。在流通、環境相互聯係,這導致病原體通過動物——動物、動物——設備——動物途徑傳播。在使用未消毒的放血工具,導致了微生物進入血液的短屍體的血液循環擴散到各個部分。最後在將牛肉進行分割時，工作人員可能使用消毒不合格的刀具或操作不當將最終產品汙染。

　　AFLP的發展和技術原理及其應用

　　AFLP(amplified fragment length polymor-phism)是1992年由荷蘭Key gene公司的Zabeau和Vos在PCR和RFLP的基礎上發展起來的新一代分子標記技術,其結合了RFLP和RAPD技術的優點,具有高分辨率、穩定性好、高效率和高靈敏度等優點,且比RFLP和RAPD技術有更大的優越性。後來,AFLP技術發展成為分析任何來源DNA指紋圖譜的一項普遍技術,並在研究植物的基礎上也開始用來研究微生物和動物,為構建遺傳圖譜、遺傳多樣性、品種鑒定等相關領域的研究提供了一個非常有效的工具。在食品加工過程中,分子分類學可以用來鑒定和跟蹤致病菌和腐敗菌的擴散。AFLP是新一代的指紋圖譜技術,其具有高重複性和高分辨率。Ifigenia等人從家禽的6個不同的加工過程、不同的設備(傳送帶、刀具、冷凍櫃、手套等)和環境中,用平板分離得到了88個Pseudomonas fluoresceds和Pseudomonas putida菌株,用AFLP技術分析,獲得了AFLP指紋圖譜,將88個菌株分為6個AFLP群,在群內菌株間具有高水平多樣性。 AFLP不僅是一種指紋技術,也是基因組研究的一個非常有效的工具。如STS(序位標)標記一樣,AFLP可以作為聯係遺傳圖譜和物理圖譜的一個橋梁;⑥AFLP分析一個重要特點是對模板DNA濃度變化不敏感;⑦AFLP另一個重要的特點是,當反應過程中標記引物耗盡時,擴增帶型將不受循環數的影響。由於AFLP對模板濃度存在一些差異,也會得到強度不一致的譜帶,所以AFLP技術能夠檢測譜帶的強度多態性;⑧AFLP技術不需要製備探針,進行分子雜交,操作簡單,易於標準化和自動化;⑨AFLP可以進行定量分析,也可作為共顯性標記。

　　AFLP技術的原理及其反應流程

　　AFLP是通過限製性內切酶片段的不同長度檢測DNA多態性的一種DNA分子標記技術,其基本原理:先利用限製性內切酶水解基因組DNA產生不同大小的DNA片段,再進行選擇性擴增,使用雙鏈人工接頭(Artificial adapter)與基因組DNA的酶切片段相連接作為擴增反應的模板DNA,用含有選擇性堿基的引物(primer)對模板DNA基因選擇性擴增,獲得的DNA擴增片段通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測,根據擴增片段長度的不同檢出多態性。為避免放射性同位素造成的危害,科研人員還將熒光標記、溴化乙錠(EB)染色和銀染等標記技術用於AFLP結果分析,使得AFLP技術更為安全可靠。

　　食源性致病菌與肉品安全

世界杯賽程預測是一個重大的世界性公共衛生問題，全球每年發生食源性疾病的病例高達40-60億例;美國每年約8100萬人患食源性疾病，5000人死亡，在食源性疾病上的花費達數十億美元;在我國食源性致病菌引起的疾病己成為威脅我國世界杯賽程預測的重大問題之一。動物在從飼養到屠宰、加工、運輸、儲藏至餐桌的過程中，環節眾多，根據危險性評估，大腸杆菌O157:H7、沙門氏菌和單增李斯特菌是三種最嚴重的牛肉源性致病菌，引起危害的可能性最大[9]。Salmonella spp. 和 E. coli O157:H7 可以由牛無症狀攜帶，與肉和肉製品的汙染密切相關[10]。在美國的食源性疾病病例中，由沙門氏菌引起的住院病例占25.6%;E. coli O157:H7 引起的住院病例占 21.7%。大腸杆菌0157：H7介紹,大腸杆菌O157:H7(Escherichia coliO157:H7)是腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)的主要血清型,其致病力強,能引起人類出血性腹瀉和溶血性尿毒綜合症(HUS)以及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等。在美國、加拿大、英國和日本等發達國家都發生過E.coliO157:H7的暴發流行。從已有的流行病學調查資料看,我國也存在散發病例,但還沒有爆發流行的報道。我國1988年首次分離到E.coliO157:H7。近幾年也通過監測,先後從牛、豬、羊、糞便,肉類等食品中查到E.coliO157:H7。在北美,牛肉中檢出E.coliO157的比例是0%～3.7%,西班牙為5.1%。EHEC O157:H7 除不發酵或遲緩發酵山梨醇外，其他常見的生化特征與大腸埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反應不完全一致，具有鑒別意義。

　　材料與方法,根據肉牛屠宰過程，分別采集糞便樣品、皮毛檫拭樣品、去皮後、去內髒後、噴淋後、冷卻後胴體擦拭樣品及分割肉等分離出的 6株菌，來源於3個樣品。實驗方法;樣品的采集 對於工序1至工序4、工序6，參照Berum等的描述采用紗布擦拭法進行采樣。簡言之，用無菌的0.9% NaCl和0.1%蛋白腖水將20cm×20cm的滅菌紗布浸潤後，依次擦拭牛二分體的13個采樣點。擦拭完成後將紗布放入均質袋中，在每個二分體的擦拭麵積約為 2500cm2。為了探明肉牛自身的帶菌率，本研究同時對糞便樣品進行了采集，按照 Madden等的描述，由工廠的工人使用滅菌刀具將牛直腸切開，在靠近肛門處用無菌手套稱取越10g直腸糞便，將直腸糞便放入均質袋。樣品抵達實驗室後，擦拭、糞便樣品每個均質袋加100ml滅菌的TSB，分割肉樣品均勻秤取25g樣品於事先加好225mlTSB的袋中。所有樣品放入均質器中均質1分鍾後，按照Barkocy的描述，采用改進的免疫磁分離方法， 放入培養箱中25℃培養2-3h、42攝氏度培養6小時。增菌後的樣品分成兩部分， 所有的操作步驟都按照說明書的指導，簡單的說，將20ul免疫磁珠加1ml的樣品中，於室溫下反應3分鍾，經過3的反複吸附，最後將抗體-抗原結合物重新懸浮於100μLPBS緩衝液中。分別取 50μL上述緩衝液分別塗布於CT-SMAC、科瑪嘉平板上，平板左邊使用滅菌棉簽塗布，右側使用接種針劃線。塗布後的平板放置37℃的恒溫培養箱中培養24小時。每個平板上挑取 3個可疑菌株，在麥糠凱瓊脂上劃線培養，挑取純化後的菌株接種MUG-LST肉湯，賴氨酸羧酶生化鑒定管，鳥氨酸生化鑒定管，吲哚生化鑒定管，MR-VP生化鑒定管，纖維二糖生化鑒定管，棉籽糖生化鑒定管，西蒙氏枸杞酸鹽生化鑒定管進行生理生化鑒定，符合 E coli O157:H7 典型特征的菌株將保存. DNA的提取 (CTAB法提取)稱取材料50mg，液氮研磨三至四次,將粉末放到裝有800µl 2×CTAB提取緩衝液的2ml離心管中,加入60µl巰基乙醇混勻，60度預熱30min,其間混勻二至三次取出樣品於室溫放置,待樣品冷卻到室溫加入800µl氯仿：異戊醇(24：1),振蕩混勻，12000rpm離心15min,取上清到一新2ml離心管，加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，振蕩混勻，12000rpm離心15min,取上清到一新2ml離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉澱液，放置20-30min，12000rpm離心15min,將沉澱晾幹溶於200µl TE-buffer(溶解).預擴增;離心數秒,按下列參數進行PCR擴增，現將模板DNA進行預變性，參數設置為94℃進行2min;先進行變性，參數設置為94℃進行30s後，進行複性，參數設置為56℃進行30s，然後進行延伸，參數設置為72℃進行80s，如此循環30次;最後進行最後的延伸，參數設置為72℃進行5min，用4℃進行保存。選擇性擴增預擴產物1:20稀釋後作為選擴模板按下列參數設置PCR循環:第一輪擴增參數：先進行變性，參數設置為94℃進行30s後，進行複性，參數設置為65℃進行30s，然後進行延伸，參數設置為72℃進行80s。 以後每輪循環溫度遞減0.7℃，擴增12輪。接著先進行變性，參數設置為94℃進行30s後，進行複性，參數設置為55℃進行30s，然後進行延伸，參數設置為72℃進行80s，如此循環23次;最後進行最後的延伸，參數設置為72℃進行5min，用4℃進行保存。

　　分析與結論

　　分子生物學方法是基於Enzyme-generated DNA片段的識別模式和DNA序列的特征正變得越來越多的用於廣泛的細菌的流行病學。在使用PCR或限製性內切酶技術之間, AFLP有許多優點而且更容易執行,比PEGE的做法更簡單和使用更少的昂貴的設備。AFLP比隨機擴增多態性DNA(RAPD)分析再次使用更方便的,它在研究標記核苷酸等要求例如需要標記核糖分型或插入序列類型時不需要Southern-blotting。

　　許多研究證明AFLP在微生物方麵的價值。AFLP在專業性和重複使用方麵已被證明。它使整個細菌基因組研究發現到由於基因突變或缺失造成在限製性位點變化成為可能。探索基因組多態性，有大量可供選擇的酶，它們幾乎有無限的可能,。AFLP對尋找基因組多態性類型是非常有用的，是其主要應用方麵。但是它在對容易確定的分子多態性的基礎方麵也很有用。在這方麵,它於突變序列類型應用相似,但它的優勢在於可以研究更多例的基因組。