柱後衍生法分析8種氨基甲酸酯農藥
氨基甲酸酯類農藥的結構特性是分子中含有一個N-甲基基團,是一類以甲酸酯為前體化合物發展而來的農藥,具有分解快、殘留低、低毒、高效、選擇性強等特點,代表品種有甲萘威(西維因)、涕滅威、呋喃丹(克百威)等。20世紀70年代以來,由於有機氯農藥品種相繼被不同國家禁用或者限製使用,以及抗有機磷農藥的昆蟲品種的日益增多,氨基甲酸酯類農藥的使用量逐年增加。
大多數氨基甲酸酯類農藥的半衰期較短,在堿性和高溫條件下容易分解,施用後短時間內就會被降解為相應的代謝產物。其代謝產物通常具有與母體氨基甲酸酯類農藥相同或更強的生物活性,例如涕滅威亞碸(涕滅威的代謝產物)與涕滅威相比,具有更強的抗膽堿酯酶的作用。因此,在測定氨基甲酸酯類農藥殘留時,必須考慮如何有效地對代謝產物進行測定。
分光光度法是較早用於氨基甲酸酯類農藥殘留測定的方法之一,由於操作繁瑣,易受其他物質幹擾,現已很少使用。從1977年第一次采用HPLC柱後衍生測定氨基甲酸酯類農藥殘留以來,采用HPLC柱後水解或柱後衍生方法對複雜介質中氨基甲酸酯類農藥的殘留量進行檢測越來越普遍。
農業標準NY/T 761-2008第三部分蔬菜和水果中氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定中,規定了該類化合物采用液相色譜法分離,柱後在線水解生成甲胺進行熒光衍生後檢測的方法。檢測原理如下:氨基基於氨基甲酸酯農藥分析需要兩級衍生,本文欲通過雙三元液相色譜左泵分析,右泵和AXP泵分別輔助衍生化,建立氨基甲酸酯柱後衍生後檢測的方法。甲酸酯類化合物經反相柱分離後,首先在100℃強堿性條件(NaOH)下水解生成甲胺;第二個柱後反應中甲胺與熒光衍生試劑鄰苯二甲醛(OPA)和2-巰基乙醇反應,生成有強熒光吸收的1-甲基-2-吲哚類化合物,進行較高靈敏度的熒光檢測。
本方法參考NY/T 761-2008 方法,建立了采用雙三元液相色譜配合AXP泵輔助柱後衍生,實現了8種氨基甲酸酯農藥的檢測,最低檢測限可達0.008~0.015mg/L,滿足NY/T 761-2008的要求。
儀器
Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000RS色譜係統,包括:DGP-3600RS色譜泵、WPS-3000TRS自動進樣器(配置100μL定量環)、TCC-3000RS柱溫箱、TCC-3000SD柱溫箱、FLD-3400RS二極管陣列檢測器、AXP泵(P/N V10PFT03DX)、Thermo ScientificTM DionexTM ChromeleonTM 色譜工作站。
耗材
Thermo ScientificTM Target2TM Nylon Syring Filters(0.45μm,30mm,P/N F2500-1);
一次性使用無菌注射器,1mL(上海治宇醫療器械有限公司);
柱後衍生反應管750μL(P/N 042631);
柱後衍生反應管375μL(P/N 043700)。
試劑與標準品
去離子水(18.2MΩ-cm,Thermo ScientificTM genPure ProTM UV-TOC,P/N 50131948);
甲萘威、克百威、涕滅威、3-羥基呋喃丹、滅多威、殺線威、涕滅威碸、涕滅威亞碸混合標準溶液,0.1mg/mL溶解在乙腈中(AccuStandard®.Inc.)、鄰苯二甲醛(98%,Alfa Aesar)硼酸、巰基乙醇、氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)。
衍生溶液的製備
衍生試劑1
50mM氫氧化鈉,稱取2g氫氧化鈉,用水(預先用氮氣吹掃3min)溶解並定容至1000mL量瓶中,搖勻備用。
衍生試劑2
0.4M硼酸緩衝液(pH=10.0):稱取24.8g硼酸,14.1g氫氧化鈉,用水稀釋並定容至1000mL容量瓶中,搖勻備用。
鄰苯二甲醛溶液:稱取200mg鄰苯二甲醛,用甲醇溶解並定容至100mL容量瓶中,搖勻備用。
鄰苯二甲醛-巰基乙醇衍生試液:取100mL鄰苯二甲醛溶液轉移至棕色容器中,加入巰基乙醇(200μL),搖勻,氮氣吹掃3分鍾,避光密封備用。
設置硼酸緩衝液與衍生試液的混合比例為4∶1,並調節混合後的溶液流速為0.3mL/min。
色譜條件
淋洗液:A:水 B:甲醇
結果
本方法中色譜分離條件采用農業部標準NY/T 761-2008中的液相條件,雙三元液相色譜其中一個泵(左泵)作分析泵,色譜柱采用Acclaim 120 C18, 5μm4.6×250mm,在30min內可實現8種氨基甲酸酯農藥的分離。8種氨基甲酸酯在色譜柱分離後,進入一級衍生,AXP泵做衍生泵,衍生溫度為100℃,衍生溫度由TCC-3000RS柱溫箱提供;二級衍生為OPA衍生,雙三元另一個泵(右泵)做衍生泵,衍生溫度為室溫。衍生後進入熒光檢測器分析,結果如色譜圖1所示。
線性範圍考察
將不同濃度的標準工作曲線溶液依次測定,取其峰麵積值,以峰麵積為縱坐標,標準溶液質量濃度為橫坐標建立標準工作曲線,得到各化合物的線性回歸方程和相關係數,如表1所示,以信噪比S/N=3計算方法的檢出限,結果見表1。
與NY/T 761-2008方法的檢出限比較,該方法靈敏度符合或優於農業部標準,如表2所示。
重複性試驗
去對照品溶液,連續進樣5針,見圖2。
測試結果表明,連續進樣5針,保留時間和峰麵積重複性均符合要求,結果見表3,表明該方法重複性良好。
討論
本文探索了利用雙三元液相色譜結合AXP輔助泵,實現氨基甲酸酯柱後兩級衍生並熒光檢測的可行性。結果表明,該方法完全可以滿足NY/T 761-2008方法的靈敏度要求。本方法所分析的化合物中,殺線威並未包含在NY/T 761-2008方法中,但在色譜圖中,殺線威和涕滅威碸出峰時間相近,如果二者在色譜柱上分離度差,勢必會對實際樣品檢測有影響,因此對於色譜柱的選擇非常重要;本方法中,殺線威和涕滅威碸的分離度為1.62,可達到完全基線分離,因此該條件下Acclaim C18, 5μm4.6×250mm色譜柱完全可以用於氨基甲酸酯的分析,此外選用Acclaim PAII, 5μm4.6×250mm色譜柱,同樣可以達到很好的分析效果。
該柱後衍生係統為實驗室自己搭建,在雙三元的基礎上,隻需額外配置一台AXP泵和常規柱溫箱即可實現氨基甲酸酯的檢測,與Pickering等柱後衍生儀相比,成本大大降低,且完全滿足NY/T 761-2008的靈敏度要求。如果用戶需要更高靈敏度的分腈中(AccuStandard®.Inc.)、鄰苯二甲醛(98%,Alfa Aesar)硼酸、巰基乙醇、氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)。
衍生溶液的製備
衍生試劑1
50mM氫氧化鈉,稱取2g氫氧化鈉,用水(預先用氮氣吹掃3min)溶解並定容至1000mL量瓶中,搖勻備用。
衍生試劑2
0.4M硼酸緩衝液(pH=10.0):稱取24.8g硼酸,14.1g氫氧化鈉,用水稀釋並定容至1000mL容量瓶中,搖勻備用。
鄰苯二甲醛溶液:稱取200mg鄰苯二甲醛,用甲醇溶解並定容至100mL容量瓶中,搖勻備用。
鄰苯二甲醛-巰基乙醇衍生試液:取100mL鄰苯二甲醛溶液轉移至棕色容器中,加入巰基乙醇(200μL),搖勻,氮氣吹掃3分鍾,避光密封備用。
設置硼酸緩衝液與衍生試液的混合比例為4∶1,並調節混合後的溶液流速為0.3mL/min。
色譜條件
淋洗液:A:水 B:甲醇
結果
本方法中色譜分離條件采用農業部標準NY/T 761-2008中的液相條件,雙三元液相色譜其中一個泵(左泵)作分析泵,色譜柱采用Acclaim 120 C18, 5μm4.6×250mm,在30min內可實現8種氨基甲酸酯農藥的分離。8種氨基甲酸酯在色譜柱分離後,進入一級衍生,AXP泵做衍生泵,衍生溫度為100℃,衍生溫度由TCC-3000RS柱溫箱提供;二級衍生為OPA衍生,雙三元另一個泵(右泵)做衍生泵,衍生溫度為室溫。衍生後進入熒光檢測器分析,結果如色譜圖1所示。
線性範圍考察
將不同濃度的標準工作曲線溶液依次測定,取其峰麵積值,以峰麵積為縱坐標,標準溶液質量濃度為橫坐標建立標準工作曲線,得到各化合物的線性回歸方程和相關係數,如表1所示,以信噪比S/N=3計算方法的檢出限,結果見表1。
與NY/T 761-2008方法的檢出限比較,該方法靈敏度符合或優於農業部標準,如表2所示。
重複性試驗
去對照品溶液,連續進樣5針,見圖2。
表2 方法檢出限與NY/T 761-2008對比
測試結果表明,連續進樣5針,保留時間和峰麵積重複性均符合要求,結果見表3,表明該方法重複性良好。
討論
本文探索了利用雙三元液相色譜結合AXP輔助泵,實現氨基甲酸酯柱後兩級衍生並熒光檢測的可行性。結果表明,該方法完全可以滿足NY/T 761-2008方法的靈敏度要求。本方法所分析的化合物中,殺線威並未包含在NY/T 761-2008方法中,但在色譜圖中,殺線威和涕滅威碸出峰時間相近,如果二者在色譜柱上分離度差,勢必會對實際樣品檢測有影響,因此對於色譜柱的選擇非常重要;本方法中,殺線威和涕滅威碸的分離度為1.62,可達到完全基線分離,因此該條件下Acclaim C18, 5μm4.6×250mm色譜柱完全可以用於氨基甲酸酯的分析,此外選用Acclaim PAII, 5μm4.6×250mm色譜柱,同樣可以達到很好的分析效果。
該柱後衍生係統為實驗室自己搭建,在雙三元的基礎上,隻需額外配置一台AXP泵和常規柱溫箱即可實現氨基甲酸酯的檢測,與Pickering等柱後衍生儀相比,成本大大降低,且完全滿足NY/T 761-2008的靈敏度要求。如果用戶需要更高靈敏度的分析,如環境方向,建議配置Pickering等柱後衍生儀。
附注1:
雙三元流路連接圖
附注2:
在實驗過程中,有幾個方麵需要注意:
(1)為保證AXP泵和雙三元衍生泵穩定的性能,需要在衍生管前連接反壓管。
(2)衍生液和色譜柱流出液進入三通管時,建議兩者以 90°方向接入,混合後流入衍生反應管。
(3)衍生管後的管路需用灰色或綠色PEEK管,或其他內徑相當管路,避免反壓過高,造成衍生管接頭漏液。
(4)第二步OPA衍生溫度為室溫,但環境溫度變化會影響基線噪音,建議可將第二路衍生管浸入燒杯中室溫水浴,可以避免溫度的劇烈變化。
(5)實驗開始後,需要按照流路從後往前的順序,關閉雙三元衍生泵、AXP泵、雙三元衍生泵;實驗結束後,需要按照流路從後往前的順序,關閉雙三元衍生泵、AXP泵、雙三元分析泵。這樣可以避免衍生流路中強堿反流進入色譜柱,造成色譜柱損傷;編輯方法關機程序時,也按照該停泵順序進行編輯。
(6)實驗結束後,需要用水徹底衝洗衍生管,避免長時間放置造成堵塞。
[責任編輯:]
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