空氣、食品接觸麵微生物檢驗方法、檢驗標準

　　1、 目的：

　　檢測生產車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸麵的機械設備的微生物指標，生產區域環境當中病原微生物的監控，達到規定標準，以控製食品成品的質量。

　　2、 參照標準：

　　中華人民共和國國家標準《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979-1995、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標準《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數測定》GB/T 18204.1-2000、中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境檢驗檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗培訓教材》中《出入食品生產廠衛生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。

　　3、 采樣與檢測方法：

　　3.1空氣的采樣與測試方法

　　3.1.1樣品采集：

　　(1)取樣頻率：

　　a)車間轉換不同衛生要求的產品時，在加工前進行采樣，以便了解車間衛生清掃消毒情況。

　　b)全廠統一放長假後，車間生產前，進行采樣。

　　c)產品檢驗結果超內控標準時，應及時對車間進行采樣，如有檢驗不合格點，整改後再進行采樣檢驗。

　　d)實驗性新產品，按客戶規定頻率采樣檢驗。

　　e)正常生產狀態的采樣，每周一次。

　　(2)采樣方法

　　在動態下進行，室內麵積不超過30 m2，在對角線上設裏、中、外三點，裏、外點位置距牆1 m;室內麵積超過30 m2，設東、西、南、北、中五點，周圍4點距牆1 m。采樣時，將含平板計數瓊脂培養基的平板(直徑9 cm)置采樣點(約桌麵高度)，並避開空調、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5 min。采樣後必須盡快對樣品進行相應指標的檢測，送檢時間不得超過6h，若樣品保存於0～4℃條件時，送檢時間不得超過24h。

　　3.1.2菌落培養：

　　(1)在采樣前將準備好的平板計數瓊脂培養基平板置37℃±1℃培養24 h，取出檢查有無汙染，將汙染培養基剔除。

　　(2)將已采集樣品的培養基在6 h內送實驗室，細菌總數於37℃±1℃培養48h觀察結果，計數平板上細菌菌落數。

　　(3)菌落計算：

　　a)記錄平均菌落數，用“個/皿”來報告結果。用肉眼直接計數，標記或在菌落計數器上點計，然後用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

　　b)若培養皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數。

　　3.2工作台(機械器具)表麵與工人手表麵采樣與測試方法：

　　3.2.1樣品采集：

　　(1)取樣頻率：

　　a)車間轉換不同衛生要求的產品時，在加工前進行擦拭檢驗，以便了解車間衛生清掃消毒情況。

　　b)全廠統一放長假後，車間生產前，進行全麵擦拭檢驗。

　　c)產品檢驗結果超內控標準時，應及時對車間可疑處進行擦拭，如有檢驗不合格點，整改後再進行擦拭檢驗。

　　d)實驗新產品，按客戶規定擦拭頻率擦拭檢驗。

　　e)對工作表麵消毒產生懷疑時，進行擦拭檢驗。

　　f)正常生產狀態的擦拭，每周一次。

　　(2) 采樣方法：

　　a)工作台(機械器具)：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表麵(取與食品直接接觸或有一定影響的表麵)取25cm2的麵積，在其內塗抹10次，然後剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

　　b)工人手：被檢人五指並攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲麵，從指尖到指端來回塗擦10次，然後剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

　　(3)采樣注意事項：

　　擦拭時棉簽要隨時轉動，保證擦拭的準確性。對每個擦拭點應詳細記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環節的消毒時間

　　3.2.2細菌·大腸菌群的檢測培養:

　　樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如汙染嚴重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。

　　3.2.2.1細菌總數：

　　(1)以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的平板計數瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。

　　(2)待瓊脂凝固後，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養48 h後計數。

　　(3)結果報告：報告每25cm2食品接觸麵中或每隻手的菌落數

　　3.2.2.2大腸菌群：

　　(1)平板法:

　　a)以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的去氧膽酸鹽瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。待瓊脂凝固後,再覆蓋一層培養基，約3-5 ml。

　　b)待瓊脂凝固後，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養24h後計數。

　　c)結果計算： 以平板上出現紫紅色菌落的個數乘以稀釋倍數得出。

　　d)結果報告：報告每25cm2食品接觸麵中或每隻手的菌落數

　　(2)試管法:

　　a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養基中，每個稀釋度接種三管。

　　b)置BGLB肉湯管於36℃±1℃培養48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。

　　c)結果報告：按BGLB肉湯管產氣管數，查MPN表報告每25cm2食品接觸麵中或每隻手的大腸菌群值。

　　3.2.3金黃色葡萄球菌檢測

　　(1)定性檢測

　　a) 取1ml稀釋液注入滅菌的平皿內，傾注15-20ml的B-P培養基，(或是吸取0.1稀釋液，用L棒塗布於表麵幹燥的B-P瓊脂平板)，放進36±1℃的恒溫箱內培養48±2小時。

　　b)從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

　　c) 結果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性，即報告手(工器具)上有金黃色葡萄球菌存在。

　　(2)定量檢測

　　a) 以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白腖大豆肉湯培養基中，每個稀釋度接種三管。

　　b) 置肉湯管於36±1℃的恒溫箱內培養48小時。劃線接種於表麵幹燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃培養45～48小時。

　　c) 從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養基，36℃±1℃培養20～24小時。

　　d) 取肉湯培養物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結果。

　　e) 報告結果：根據凝固酶試驗結果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸麵中或每隻手的金黃色葡萄球菌值。

　　3.3工廠環境中病原體的檢測計劃與方法

　　檢測計劃：為了保證世界杯賽程預測，工廠應該對生產環境中的病原微生物進行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應該按照一定的計劃對生產場所環境中的病原體進行檢測，其中包括地麵、下水道、 排水溝、牆壁、天花板、設備框架、運輸的支架，冷藏裝置、速凍機、傳送帶、設備的螺絲、維修工具等部位。當某個點檢測到病員微生物時，應該對環境中的相似點加大檢測頻率;在把所有的預定點檢測完後，應該對環境中的病原微生物的存在狀況進行全麵評估，在下一次環境檢測循環過程中加強檢測容易出現病原體的環境點，達到持續改進的目的。

　　檢測頻率:每月兩次,每次每個區域至少選取5個檢測點,分別進行檢測。

　　3.3.1環境李斯特菌的檢測方法(3MTM PetrifilmTM環境李斯特菌的測試片)

　　3.3.1.1用塗抹棒，海綿或者其他采樣設備收集環境樣本。

　　3.3.1.2將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩衝蛋白腖水，將樣本與緩衝蛋白腖混合1分鍾，將樣品置於室溫(20-30℃)1小時，最久不超過1.5小時，以修複損傷的李斯特菌。

　　3.3.1.3將測試片放在平坦處，掀起上層膜。

　　3.3.1.4用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產生氣泡。

　　3.3.1.5輕輕將塑料壓板放在位於接種區上層膜上，不要壓，扭轉或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鍾，以使膠體凝固。

　　3.3.1.6將測試片透明麵朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養26-30小時，可以用標準菌落記數器或者其他光學放大器判讀，不要記數圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養基的影響。

　　3.3.1.7對於定性檢測，根據紫紅色菌落是否存在，結果記為檢出或者未檢出。

　　3.3.2環境中沙門氏菌的檢測方法

　　3.3.2.1采樣地點:選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方

冷凍車間		FD車間
東區初加工	傳遞窗口表麵、排水溝、 排水溝出口、牆壁、地麵	卸料間	牆壁、牆角、地麵、天花板、 物料車表麵
東區精加工	地麵、牆壁、牆角、排水溝、 排水溝出口、速動機鏈條、天花板	暫存間	牆壁、地麵、天花板、牆角、牆縫
西區初加工	傳遞窗口表麵、地麵、牆壁、 排水溝、排水溝出口	挑選間	牆壁、地麵、天花板、牆角、墊板
西區精加工	地麵、牆壁、牆角、排水溝、排水溝出口、速動機鏈條、天花板	包裝室	牆壁、地麵、天花板、金探傳送帶表麵、落地料存放處

　　3.3.2.2操作步驟

　　3.3.2.2.1采樣應在生產開始後進行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表麵旋轉塗抹約100cm2的麵積，然後將棉拭放回塗抹試管並蓋緊。

　　3.3.2.2.2將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品,登記編號,按照SN0170-92標準及時檢測，若有陽性結果出現，應逐步對所混合的每個點分別檢測。

　　物體表麵塗抹菌落總數計算方式：物體表麵細菌總數(cfu/c㎡)=平皿上菌落的平均數*采樣液稀釋倍數/采樣麵積(cm2)

　　根椐GB15979-2002《一次性衛生用品衛生標準》的標準,生產環境衛生指標

　　1裝配與包裝車間空氣中細菌菌落總數應≤2 500 cfu/m3。

　　2工作台表麵細菌菌落總數應≤20 cfu/cm2。

　　3.工人手表麵細菌菌落總數應≤300 cfu/隻手，並不得檢出致病菌。

　　人員和環境衛生檢測方法

　　一、 空氣采樣及檢驗方法

　　1培養基：普通營養瓊脂平板，按GB4789.28中3.7條配製

　　2采樣(空氣沉降法)

　　2.1布點：麵積小於30平方米的車間，設一對角線，在線上取3點，即中心一點，兩端在距牆1米處各取一點;麵積大於30平方米的車間，設東、西、南、北、中5個點，其中東、西、南、北點均距牆1米。

　　2.2采樣高度：與地麵垂直高度80-150厘米。

　　2.3采樣方法;用直徑為9厘米的普通營養瓊脂平板在采樣點上暴露20分鍾蓋上送檢培養。

　　3培養：於37℃培養24小時。

　　4檢測頻率：每周

　　空氣質量標準：

　　生車間、熟車間、成品車間：低於100個

　　半成品庫、成品庫：低於10個

　　二、設備的采樣與檢驗方法

　　根據生產過程所要求的重點衛生部位，實驗室對其進行塗抹采樣，進行細菌總數檢驗。

　　1采樣方法

　　1.1塗抹法(適用於表麵平坦的設備和工器具產品接觸麵)

　　取經過滅菌的鋁片框(框內麵積為50平方厘米)放在需檢查的部位上，用無菌棉球蘸上無菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分，擦完後立即將棉球投入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。

　　1.2貼紙法(適用於表麵不平坦的設備和工器具接處麵)

　　將無菌規格紙(5×5厘米，紙質要薄而軟)用無菌生理鹽水泡濕後，於需測部分分別貼上兩張，兩張紙麵積共50平方厘米，然後取下放入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。

　　2檢驗方法

　　2.1細菌總數的檢驗

　　將上述樣液充分振搖，根據衛生情況，相應地做10倍遞增稀釋，選擇其中2-3個合適的稀釋度作平皿傾注培養，培養基用普通營養瓊脂，每個稀釋度作2個平皿，每個平皿注入1毫升樣液，於37℃培養24小時後計菌落數。

　　結果計算

　　表麵細菌總數(cfu/cm2)=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數/30×2

　　2.2致病菌的檢驗

　　沙門氏菌，參照GB4789.4進行

　　金黃色葡球菌，參照GB7918.5進行

　　4.檢驗合格標準：細菌總數10-100個∕cm2，

　　5.關鍵點：細菌總數≤10個∕cm2

　　一般區域：細菌總數≤100個∕cm2

　　三、人員手表麵細菌汙染情況的檢驗

　　1. 采樣方法：用一支蘸有無菌生理鹽水的棉拭子塗擦被檢對象手的全部，反複兩次，塗擦的時候棉拭子要相應地轉動，擦完後，將手接觸部分剪去，將棉拭子放入裝有10毫升無菌生理鹽水的試管內送檢培養。

　　2. 檢驗方法：同工器具表麵細菌總數檢驗方法。

　　3. 結果計算：每隻手表麵的細菌總數(cfu/隻手)=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數

　　四、消毒液藥效的微生物學鑒定法

　　1采樣對象：正常使用的消毒液，和已知配製好備用的消毒液

　　2采樣及檢驗方法

　　在無菌條件下，用無菌吸管吸取1毫升樣液，加入9毫升稀釋液中混勻，對於醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養肉湯即可;對於含氯消毒劑、含碘消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉，對洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在肉湯中加入3%(W/V)土溫80和0.3%卵磷脂;對醛類消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸;對於含有表麵活性劑的各種複方消毒劑，需在肉湯中加入(W/V)土溫80，以中和被檢樣液中的殘效作用，

　　將注入了樣液的稀釋液充分搖勻，取1毫升注入平皿，隨之倒入普通營養瓊脂，待瓊脂凝固後，翻轉平皿，將平皿於37℃條件下培養24小時後計平板上生長的菌落數。

　　3結果分析

　　平板上有菌生長，表明被檢樣液中有殘存活菌，若每個平板菌落數在10個以下，仍可用於消毒，若每個平板菌落數超過10個，說明每毫升被檢樣液含菌量已超過100個，即不宜在用於消毒。

　　該公式是一個經驗公式.它的理論模式依據是:100CM2的麵積上10MIN降落的菌落數,

　　等於1升空氣中所含的細菌總數.係數50000基於上述假說和單位換算而來.

　　細菌總數(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

　　5/10T:實際放置了5MIN;

　　100/A:A單一培養皿麵積;

　　1000:1M3=1000L啊,換算成m3

　　1、空氣細菌落菌數單位既然是cfu/m3，那采樣時應該還要記錄放置平皿的高度。

　　2、世界杯賽程預測管理體係中罐頭行業有個標準如下：

　　落下菌數 空氣汙染程度 評價

　　30以下 清潔 安全

　　30～50 中等清潔

　　50～70 低等清潔 應加注意

　　70～100 高度汙染 對空氣要進行消毒

　　100以上 嚴重汙染 禁止加工

　　3、是否可根據企業相應的加工產品微生物指標進行自行製定?