□ 何瑛 林木娣 賴書瑩 劉傳栩 梁俊健 廣東燕塘乳業股份有限公司檢測中心

　　摘 要：本文建立了使用紫外分光光度計測定原料乳及乳製品中硫氰酸鈉含量的方法，方法利用硫氰酸鈉與硝酸鐵反應產物硫氰酸鐵的光度值間接測定硫氰酸鈉的含量。結果顯示，吸光度與硫氰酸鈉質量濃度線性關係、檢出限實驗、重複性實驗、回收率實驗等方法學實驗均效果良好，測得結果與離子色譜法結果沒有顯著性差異，提示方法可行，適於乳品企業對硫氰酸鈉的快速檢測。

　　關鍵詞：硫氰酸鈉 紫外分光光度法 硝酸鐵 乳及乳製品硫氰酸鈉(NaSCN)是生乳中天然存在的一種活性抗菌體係，其乳過氧化物酶體係(LPS)可以抑菌保鮮。1991年，WHO和FAO的食品法典委員會公布的CAC/GL 13-1991《乳過氧化物酶體係用於原料乳的保鮮指南》中，硫氰酸鈉作為LPS的活化劑[1]被允許添加到牛奶中;我國也於隨後頒布標準，允許將其添加到無冷鏈運輸體係中用於原料乳保鮮，添加量為15mg/L[2～3]。

　　但硫氰酸鈉屬有毒有害物質，其主要毒性作用為以抑製細胞色素氧化酶活性為主的急性毒性與以抑製碘轉運及甲狀腺素合成的慢性毒性，尤其對胎兒和嬰兒的腦部與神經係統發育存在較大的危害[4]。隨著社會對世界杯賽程預測重視度提高及原奶冷鏈運輸的完善，國家廢除了之前的標準並於2008年12月公布《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》，規定乳及乳製品中硫氰酸鈉屬違法添加物質。

　　目前，我國尚未製定檢測牛奶中硫氰酸鈉的標準及限值。本文采用紫外分光光度法測定牛奶中硫氰酸鈉含量，與離子色譜法相比，其操作簡捷且結果準確，儀器易普及，適合在各乳品企業推廣使用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　1.1.1 材料

　　生乳采自廣東、福建、廣西、天津等地的奶牛場;原料乳粉為新西蘭進口奶粉;乳製品包括市售巴氏殺菌乳、UHT滅菌乳、調製乳等。

　　1.1.2 試劑

　　1.1.2.1 三氯乙酸溶液(200g/L)：稱取三氯乙酸200.0g，用純水溶解並稀釋至1000mL;

　　1.1.2.2 硝酸鐵溶液(16g/L)：稱取硝酸鐵(Fe(NO3)3•9H2O)2.674g，用純水溶解並稀釋至100mL，加入2mL濃硝酸，避光保存;

　　1.1.2.3 硫氰酸鈉標準儲備液(1000mg/L)：將硫氰酸鈉標準品(光譜純，GR)置於80℃烘箱內幹燥2h，準確稱取幹燥後的硫氰酸鈉0.1000g於100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻後置於4℃避光保存;

　　1.1.2.4 硫氰酸鈉標準工作液(100mg/L)：準確吸取1.00mL硫氰酸鈉標準儲備液到10mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻後備用，該試劑應現配現用。除非另有說明，本實驗中使用的均為分析純試劑和GB/T 6682-2008中規定的一級水。

　　1.1.3 儀器設備

　　UV-1800紫外可見分光光度計，電子分析天平，離心機，電熱恒溫鼓風幹燥箱，渦旋振蕩器，移液槍。

　　1.2 方法建立

　　1.2.1 實驗原理

　　牛奶中加入三氯乙酸(TCA)除去蛋白質和脂肪，過濾後取上清液加入高鐵化合物，利用硫氰酸根與三價鐵離子在pH值為1.0～1.5的條件下反應生成血紅色的硫氰酸鐵絡合物[5]，在最大吸收波長處測定吸光度值，根據吸光度標準曲線確定其中硫氰酸鈉的含量。

　　1.2.2 樣品處理

　　(1)生乳或液態乳製品：吸取15mL樣品於50mL的離心管中，邊振搖邊加入三氯乙酸溶液(1.1.2.1)10mL，充分混勻後靜置15～30min，然後將樣品離心(9000rad/min，3min)分離，上清液經定性濾紙雙層過濾、棄去初濾液後待測。(2)乳粉：稱取10.0g奶粉於200mL燒杯中，用65～80℃溫水1︰10進行溶解，冷卻後吸取該溶液15mL於50mL離心管，同1.2.2.1處理。

　　1.2.3 樣品測定

　　分別吸取4mL待測液於10mL比色管中，加入2mL硝酸鐵溶液(1.1.2.2)，混勻，反應10min後在450nm波長處測定吸光度值，以三氯乙酸溶液加顯色劑作為試劑空白調零。測得的反應液吸光值應減去樣品濾液的本底吸光值，得到淨吸光值,將淨吸光值代入標準曲線計算出樣品中硫氰酸鈉的含量。

　　1.2.4 標準曲線的繪製

　　取10mL比色管7支，選擇反應液淨吸光度值與試劑空白最接近的樣品濾液作底液，分別吸取0、20、40、80、160、320、640μL硫氰酸鈉標準工作液(1.1.2.4)，用底液定容至4mL，配製成濃度為0、0.5、1、2、4、8、16mg/L的硫氰酸鈉基質加標溶液，然後加入2mL硝酸鐵溶液混勻後靜置10min顯色，以試劑空白調零，在450nm波長處測定吸光度值，將測得的吸光值減去底液吸光值後得到的淨吸光值對硫氰酸鈉質量濃度作圖。

　　1.2.5 計算

　　樣品中硫氰酸鈉的含量按以下公式進行計算：

　　其中：C為樣品中硫氰酸鈉的含量，mg/L;C0為由標準曲線得出的待測濾液中硫氰酸鈉的含量，mg/L;V1為取樣量，mL;V2為樣品最終體積，mL;f為稀釋倍數，液態樣品f=1，固態樣品f=10。

　　2 分析與討論

　　2.1 沉澱劑的加入量

　　實驗分別加入不同量的三氯乙酸溶液對樣品中的蛋白質進行沉澱、離心(9000rad/min，3min)和過濾，然後將濾液靜置一段時間觀察沉澱效果，結果見表1，最終選擇樣品與沉澱劑的比例為30︰20進行前處理。

　　2.2 檢測波長的確定

　　取16mg/L的硫氰酸鈉基質加標溶液，顯色後在400～700nm可見光區進行光譜掃描(見圖1)，在此區域內溶液於波長450nm處有1個最大吸收峰，此時樣品的吸光度值最大，響應最靈敏，且該波長前後吸收曲線斜率較小，故選擇450nm作為檢測波長。

　　2.3 顯色劑及反應時間的確定

　　硫氰酸鈉能與Fe3+反應生成硫氰酸鐵紅色絡合物。實驗初期考慮使用FeCl3溶液作為顯色劑，但其顯色不穩定且本底顏色較深，影響結果的準確測定;而Fe(NO3)3溶液中加入少量的濃硝酸後可抑製Fe3+的水解，本底顏色淺，可作為顯色劑使用，實驗發現其用量對顯色效果有明顯影響。

　　由圖2可以看出，取4mL 20mg/L硫氰酸鈉基質加標溶液進行顯色反應，反應液吸光值隨Fe(NO3)3加入量的增大而增大，當加入量為2mL時，曲線斜率較大，之後趨於平緩。實驗選定濾液與顯色劑的用量為4︰2並進行顯色穩定性實驗，結果如表2所示。

　　由表2可得，隨著反應時間的推移，至反應後1h內，不同濃度的硫氰酸鈉基質加標溶液吸光值(OD值)變化不大，根據實際操作情況，本實驗選定顯色反應時間為10min。

　　2.4 標準曲線底液的選擇

　　實驗發現牛奶底液成分對測定結果的影響較大，分別用純水、三氯乙酸溶液、空白奶樣(反應液淨吸光度值與試劑空白最接近的樣品，經離子色譜法測定未檢出NaSCN)濾液作為底液配製標準曲線，測得的硫氰酸鈉加標回收率如表3所示，最終選擇空白奶樣濾液作為本底構建標準曲線。

　　3 結果與驗證

　　3.1 標準曲線的建立

　　按1.2.4的步驟進行實驗，以硫氰酸鈉基質加標溶液的濃度為橫坐標，對應的淨吸光度值為縱坐標，建立標準曲線如圖3所示，得到回歸方程y=0.021x+0.021，相關係數R2=0.9997。可見，硫氰酸鈉濃度為0～16mg/L範圍內，其質量濃度與吸光度線性關係良好。

　　3.2 檢出限與回收率實驗

　　按上述方法進行20次空白溶液測量，得到標準偏差S=0.0005，分別以3倍、10倍標準偏差除以工作曲線斜率計得方法最低檢出限為0.07mg/L，最低定量限為0.25mg/L。

　　為驗證曲線可靠性，任意選取一種奶樣進行加標回收實驗。分別吸取硫氰酸鈉標準儲備液0.015、0.03、0.06、0.18、0.30、1.20mL，加入液體奶樣至60mL，充分混勻後吸取15mL按上述方法進行實驗，每個標樣平行測定3次，取平均值計算回收率，結果見表4。實驗測得回收率在95.24%～101.19%之間，準確度較高。

　　3.3 重現性實驗

　　任意選取生乳、原料乳粉、純牛奶和調製乳樣品各一個，按上述方法進行處理，平行測定6次，實驗結果見表5。由表5可見，重複實驗結果相對標準偏差在1.16%～2.38%之間，本方法對原料乳及乳製品中硫氰酸鈉含量的測定重現性良好。

　　3.4 與離子色譜法的比較

　　取各類牛奶樣品6個，分別用離子色譜法和紫外分光光度法測定硫氰酸鈉含量，檢測結果如表6所示。對兩組數據作t檢驗，t=0.361

　　4 總結

　　實驗測得各大牧場生乳樣品中硫氰酸鈉的含量在0.25～5mg/L之間，檢出率較高但含量較低，可排除人為添加的可能，係屬於奶牛防禦體係天然存在的硫氰酸鹽。本法具有操作簡捷、成本低、靈敏度較高、重現性好、回收率高的特點，與離子色譜法測得結果之間無顯著性差異，適用於生鮮乳、原料乳粉及加工後的乳製品中硫氰酸鈉的快速測定。

　　參考文獻

　　[1] 李瀅倩.離子色譜和高效液相色譜測定牛乳中硫氰酸鹽含量的研究[D].吉林：吉林大學，2010：2-3.

　　[2] 中華人民共和國國家技術監督局. GB/T 15550-1995活化乳中乳過氧化物酶體係保存生鮮牛乳實施規範[S]. 北京：中國標準出版社，1995.

　　[3] 中華人民共和國衛生部. GB 2760-1996食品添加劑使用衛生標準[S]. 北京：中國標準出版社，1996.

　　[4] 蔭碩焱，賀巍巍，趙凱等. 乳品中硫氰酸鹽的世界杯賽程預測對策[J].衛生研究，2013，42(3)：529-631.

　　[5] 王丹慧，張鳳梅，李梅等. 鐵鹽法定量檢測原料乳中硫氰酸鹽[J]. 食品科學，2010，31(18)：298-300.