□ 陶文靖 北京良潤生物科技有限公司

　　摘 要：本文比較分析了國內外李斯特菌的檢測方法、不同標準限量值的差異，並介紹了國內外李斯特菌快速檢測技術的應用及存在的問題，對我國微生物快速檢測的現狀進行了概述，探討了李斯特菌快速檢測技術的未來發展方向，對李斯特菌檢驗方法探索及快速檢測技術的發展具有一定的借鑒意義。

　　關鍵詞：李斯特菌 快速檢測 免疫學檢測 分子學檢測

　　李斯特菌廣泛存在於環境中，並且在很多食品中有檢出，該菌在低溫的條件下仍能存活和增殖，其中單核細胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的主要致病菌之一，也是世界杯賽程預測控製的重要病原體，感染後會造成不同程度的人員死亡，受到各國的高度重視。傳統方法檢測費時費力而靈敏性較差，因此，快速、高效、靈敏可信的檢測方法能夠更加有效判定李斯特菌汙染風險並且控製其危害。

　　1 李斯特菌的汙染及危害

　　李斯特菌在環境中普遍存在，也是汙染食品的主要病原菌，往往侵染肉類、蛋類、禽類、海產品、乳製品、蔬菜等食品，在4℃的環境中仍能生長繁殖，是冷藏食品中主要的病原菌之一。其中，單核細胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的重要病原菌，WHO將其列為21世紀四大食源性致病菌之一[1]。近年來，單核細胞增生李斯特氏菌引起的食源性疾病事件時有發生(見表1)，並造成不同程度的人員死亡，受到了各國的高度重視。

　　2 國內外關於食品中

　　李斯特菌限量的規定

　　李斯特菌極容易汙染食品，其中對冷藏食品和即食食品危害最為嚴重，各國均製定了食品中李斯特菌的限量值和監測計劃。美國對即食食品中單增李斯特菌的限量規定為0/25g，並要求企業實施GHP和HACCP[2]。中國香港2014年修訂了對即食食品和指定食品中單增李斯特菌的限量值並分別做了規定。冷藏食品(冷凝食品除外)或嬰兒食品中單增李斯特菌必須“在25g食物樣本中沒有發現”，其他即食食品中單增李斯特菌的限量為食物樣本中小於100CFU/g[3]。中國大陸2013年頒布的《食品中致病菌限量標準GB29921-2013》中規定[4]，在即食肉製品中，單增李斯特菌按照二級采樣方法取樣不得檢出(n=5，c=0，m=0)。也有一些國家，如新西蘭等國家並沒有製定相關的規定，僅製定了一個對人類健康不存在風險的可接受水平。綜上，雖然各國均對單增李斯特菌做出了限量要求，但是對李斯特菌的限量各國的要求不一，見表2。

　　3 國內外主要檢驗方法

　　目前，食品微生物檢測體係主要包括，中國的國家標準(GB4789)和檢驗檢疫行業標準(SN)、國際化標準化組織(ISO)方法、美國食品藥品監督局(FDA)、美國農業部(USDA)、美國官方分析化學師協會(AOAC)、加拿大健康保護部(MFLP)、歐盟世界杯賽程預測局(EFSA)等檢測體係[5]。

　　食品中單增李斯特菌的傳統檢測方法主要包括增菌、分離和鑒定3個環節[6]。目前，分離環節常會采用顯色培養基，使其菌落顏色不同於其它幹擾菌，實現快速分離。鑒定常采用生化反應和血清學反應。目前，生化反應的鑒定技術多采用數值分類鑒定和自動化檢測技術。該技術主要包括：(1)API Listeria生化鑒定試紙條;(2)全自動微生物分析係統，如VITEK係統、MIDI係統及BIOLOG係統等。雖然該方法結果互認程度高，但操作強度大、檢驗周期長，需6～7d，無法實現快速檢測。表3介紹了ISO、USDA、FDA、中國國標和行標等檢測方法。

　　4 李斯特菌快速篩查技術

　　傳統方法檢測費時費力操作要求高，因此，李斯特菌快速檢測技術和產品的開發是必要的。美國、歐盟等發達國家對微生物快速檢測方法的研究和產品認證體係相對成熟，各種不同的快檢係統和自動化儀器被推出，並得到廣泛的應用。當前，李斯特菌快速檢測方法為增菌以後，生化鑒定之前，對樣本進行快速篩選，以縮小檢測範圍，減少檢測任務，提高檢測效率。快速檢測方法主要包括酶底物顯色技術、免疫學和分子生物學檢測三大類。

　　4.1 即用培養技術

　　即用培養基技術則省掉了前期準備工作，可以直接檢測樣品，從而節約了大量人力成本。目前，商業化的固定培養基技術主要有兩種：紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養基固定於紙片上，上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜，以方便計數。即用平皿法是指用已倒有培養基的平皿，接種操作與傳統塗板、劃線法一樣。其優點和紙片法一樣，即省掉了前期準備工作，可以直接接種培養。

　　4.2 免疫學檢測法

　　該技術以抗原抗體免疫為基礎，製備特異性克隆抗體檢測細菌。目前國內外李斯特菌快速檢測的此類技術主要包括：酶聯熒光分析法(ELFA)、金標免疫層析技術、流式細胞技術等。ELFA靈敏度比ELISA高，並省去了ELISA中的顏色反應，縮短反應時間;但缺點是成本較高，目前主要應用在自動酶聯熒光免疫檢測係統(VIDAS)上[7]。金標免疫層析技術是將高度特異性抗單增李斯特菌抗原的抗體束縛在色原載體上，且可與固相支撐基質相分離。當檢測樣品中存在李斯特菌時，測試單元的試劑將會被展開，產生肉眼可見的確定性反應。流式細胞術是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段[6]，它可以高速分析上萬個細胞，並能同時從一個細胞中測得多個參數。

　　4.3 分子學檢測方法

　　分子生物學檢測方法主要包括核酸探針雜交技術、PCR檢測技術等。DNA探針法是將兩條堿基互補的DNA鏈在適當的條件下雜交，通過檢測樣品與標記性DNA探針之間形成的雜交分子來檢測樣品中的單增李斯特菌，測定放射性或熒光強度即可得出樣品中單增李斯特菌的個數[8]。PCR是近年來廣泛應用的分子生物學檢測方法，在單增李斯特菌的檢測中以其遺傳物質高度保守的核酸序列(常用的靶序列包括hly、actA、prfA等)設計引物進行擴增。該方法特異性好，但靈敏度低，對樣品進行前處理後再進行擴增，可以提高檢出率和檢測靈敏度。PCR技術還可對單增李斯特菌進行定量檢測。國內外目前主要應用的PCR技術包括：實時熒光PCR(Real-time PCR)、多重PCR、恒溫擴增、RT-PCR方法、IMS-PCR檢測技術等[9]。

　　5 小結

　　微生物檢測包括前處理、增菌、富集、檢測等環節。為實現快速、實時、準確的監測食品微生物，每個環節都應有相應的篩查技術及產品。微生物快速檢測今後的發展趨勢主要是免疫學方法和核酸方法，分子檢測技術具有高靈敏、高特異、快速等特點，在近幾十年得到快速發展與應用，但相關技術還應向標準化、產品化方向發展，且開發更適合實時監測微生物的現場快速篩查技術與設備。免疫技術以高特異、快速特點而得到廣泛應用。我國在微生物快速檢測技術的應用及技術研發方麵相對歐洲國家比較落後，快速檢測技術的發展和應用需要政府相關機構、科研單位、企業共同的努力建立一套快速、準確、簡單的檢測體係，此外，還需要降低檢測成本，提供檢測靈敏度和實用性，這些是今後微生物快速檢測的發展趨勢。

　　參考文獻

　　[1] Oevermann A,Zurbriggen A, Vandevelde M.Rhombencephalitiscaused by Listeria monocytogenes in humans andruminants: a zoonosis on the rise[J]. Interdisciplinary PerspectInfect on Infectious Diseases, 2010, 11(5): 142- 168.

　　[2] FAO/WHO.Food safety risk analysis-A guide for national food safety authorities[M].FAO Food and nutrition paper87.2006.

　　[3] 香港食品環境衛生署.香港食品微生物含量指引[S].2014.

　　[4] GB 29921-2013世界杯賽程預測 國家標準 食品中致病菌限量標準[S].2013.

　　[5] 何景,程楠,許文濤等.食品微生物新型快速篩查技術研究發展[J].食品科學,2014,10:1-8.

　　[6] 劉秀梅,楊洋,陳偉偉等.單核細胞增生李斯特氏菌檢驗(GB/T4789.30-2010)[S].北京：中國標準出版社,2012.

　　[7] 呂均,鄭華英.PCR與mini-VIDAS 相結合快速檢測食品中單增李斯特菌[J].中國衛生檢驗雜誌,2010,20(7):1705-1706. 


　　[8] 華曉芳,黃雪鬆.食品中單增李斯特菌的檢測新技術[J].食品科技, 2007(6):230-232.


　　[9] 付瑞燕，周陽，祝長青等.食品中單增李斯特菌檢測技術研究進展[J].安徽農業大學學報，2012，3(6)：940-943.