□ 劉靜 陝西學前師範學院

　　摘 要：合成了一種菁染料-b-環糊精化合物(Dye-b-CD)，采用紫外-可見光譜法探討了以這種菁染料-b-環糊精作為帶有熒光探針的主體化合物在食品檢測中的應用。結果表明：該菁染料-b-環糊精能夠在pH=7.2的緩衝溶液介質對Cu2+進行定量識別，根據Benesi-Hildebrand方程確定該菁染料-b-環糊精與硝酸鉻包結比為1，其包合常數為2.51×105 L/mol ，合成的菁染料-b-環糊精化合物能夠有效的對食品中銅含量進行測定。

　　關鍵詞：菁染料-b-環糊精;紫外-可見光譜;食品檢測

　　中圖分類號：O657.31 文獻標識碼：A 文章編號：

　　人體血液中，銅與鐵有著同樣重要的地位，銅是鐵的“助手”。人體中，能夠吸收銅的部位主要是胃和小腸上部。當銅在人體中被吸收後，進入人體血液中，80%的結合成血漿銅藍蛋白。銅在血紅蛋白形成中的作用，一般認為是促進對腸道鐵的吸收和從肝及網狀內皮係統的貯藏中使它釋放出來，故銅對於血紅蛋白的形成起著重要作用。

　　從食品商品化的角度來看，少量的銅對產品質量的影響主要是在食油及含不飽和脂肪的食品中，銅離子實際上起著催化劑的作用，造成食品酸敗、變色和其他一些反應。這些影響盡管使產品在外觀上不受人歡迎，但通常並不會引起中毒和降低食品的營養價值。

　　食物中銅的豐富來源有口蘑、海米、紅茶、花茶、磚茶、榛子、葵花子、芝麻醬、西瓜子、綠茶、核桃、黑胡椒、可可、肝等。良好來源有蟹肉、蠶豆、蘑菇(鮮)、青豆、小茴香、黑芝麻、大豆製品、鬆子、龍蝦、綠豆、花生米、黃豆、土豆粉、紫菜、蓮子、芸豆、香菇(香菇食品)、毛豆、麵筋、果丹皮、茴香、豌豆、黃醬、金鐵菜、燕麥片、栗子、堅果、黃豆粉和小麥胚芽。一般來源有杏脯、綠豆糕、酸棗、番茄醬、青梅果脯、海參、米花糖、香蕉、牛肉、麵包、黃油、蛋、魚、花生醬、花生、豬肉和禽肉。微量來源有巧克力、豌豆黃、木耳、麥乳精、豆腐花、稻米、動物脂肪、植物油、水果、蔬菜、奶及奶製品和糖。

　　目前，食品中銅含量的測定主要依照標準GB/5009.12-2003，其中規定的檢出限分別為：石墨爐原子吸收光譜法5μg/kg;氫化物原子熒光光譜法固體試樣為5μg/kg，液體試樣為1μg/kg;火焰原子吸收光譜法0.1mg/kg;比色法為0.25mg/kg;單掃描極譜法為0.085mg/kg。而國家規定的衛生指標中，要求糧食、豆類、蔬菜、水果、肉類、水產類和蛋類的銅含量分別小於或等於10mg/Kg、20mg/Kg、10mg/Kg、10mg/Kg、10mg/Kg、50mg/Kg和5mg/Kg。這就使得在使用石墨爐原子吸收光譜法等常規手段檢測食品種銅含量時要將樣品稀釋至合適的濃度，如果樣品中銅含量過高，則使得樣品的準備工作較為繁複，造成測量誤差較大。

　　為應對石墨爐原子吸收光譜法等常規檢測手段檢測範圍較窄等缺點，本工作采用3-吲哚甲醛對β-環糊精進行修飾，合成一種菁染料-β-環糊精：單-6-脫氧-6-[4-(2-甲基-2-苯並惡唑次甲基)吡啶鎓]-β-環糊精碘鹽，研究以其作為帶有熒光探針的主體化合物對樣品中Cu2+的定量識別作用，為采用光譜法使用具有熒光探針的主體化合物進行食品中Cu2+提供實驗基礎。

　　1 實驗

　　1.1 儀器和試劑

　　β-環糊精，硫酸銅、對甲苯磺酰氯、乙腈、吡啶和DMF均為分析純。光譜實驗所用溶劑為甲醇-水(3:7)的混合溶液，配製成pH=7.2的NaH2PO4-Na2HPO4緩衝溶液(0.1mol/L)。F-4500型熒光光譜儀(日本島津公司);INOVA-400MHz型核磁共振儀(美國Varian公司);EQUINOX-55型傅立葉紅外光譜儀(德國布魯克公司);AXIMA-CFR™ plus基質輔助激光解吸附電離飛行質譜儀(島津集團);Vario EL-III 元素分析儀(德國艾樂曼元素分析係統公司);UV-1700紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

　　1.2 菁染料-b-環糊精的合成及表征[12]

　　合成路線：

　　1.2.1 單-6-脫氧-6-對甲基苯磺酰-β-環糊精的製備

　　在三口燒瓶中加入β-環糊精、NaOH分別為60.00g、6.28g，然後加入500.0mL水作為溶劑，降溫至6℃，使其完全溶解;將對甲苯磺酰氯溶液10.08g溶於30.0mL乙腈中，攪拌在10min內緩慢滴加至三口燒瓶中。待對甲苯磺酰氯溶液滴加完畢，將反應液升溫至30℃，繼續反應12h，抽濾，得到的濾液於4℃下靜置24-48h，抽慮並真空幹燥，得6.50g單-6-O-(對甲苯磺酰基)-β-環糊精白色固體(1)，產率14.1%。

　　1.2.2 單-6-脫氧-6-(2-甲基吡啶鎓)-b-環糊精對甲苯磺酸鹽的合成

　　在三口燒瓶中加入單-6-O-6-(對甲基苯磺酰基)-β-環糊精(1)和4-甲基吡啶分別為5.40g(4.20mmol)和24.0mL，裝上帶有幹燥管的冷凝管，加熱至85℃下，反應12h。待反應完畢收，冷卻至室溫，將其倒入大量丙酮中，得到肉紅色固體，抽濾得粗品，分別用水和丙酮洗滌純化、真空幹燥得到5.20g肉色固體粉末單-6-脫氧-6-(4-甲基吡啶鎓)-β-環糊精對甲基苯磺酸鹽(2)，熔點：267~269℃，產率87%

　　1.2.3 單-6-脫氧-6-[4-(3-乙基-3-吲哚)吡啶鎓]-β-環糊精碘鹽的合成

　　在圓底燒瓶中分別加入2.74g(2.00mmol)單-6-脫氧-6-(4-甲基吡啶)-β-環糊精對甲基苯磺酸鹽(2)、3-吲哚甲醛0.30g(2.04mmol)，用DMF20.0mL溶解，然後加入約0.8mL呱啶使溶液變成黃棕色，加熱至85~90℃，反應下3h。待反應完全後，冷卻反應液至室溫，並倒入大量丙酮中，生成大量黃色沉澱，抽濾，真空幹燥。粗產物用少量水溶解、然後加丙酮析出、抽濾、用丙酮浸泡，進行初步純化後，使用矽膠色譜柱進一步純化，洗脫液為V(水):V(乙醇)=6:1混合溶劑，柱層析後再用V(水):V(乙醇)=3:1混合溶劑重結晶，得0.56g產物(3)，產率19%，熔點大於300 ℃。

　　產品結構經過UV-vis, 1HNMR, IR, 元素分析及飛行質譜證實：紅色固體. UV-vis (MeOH): λmax=452.0 nm; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 2.29 (s, 1H), 3.17 (s, 2H,), 3.55-3.47 (m, 59H), 3.99 (s, 1H,), 5.78(s, 1H), 6.41 (s, 2H), 6.44 (s, 1H), 6.65 (s, 1H),6.85(m, 1H), 8.63 (m, 2H), 9.35(m, 2H, ); IR (KBr) υ: 3385 (s, υ-OH), 2928 (w, υC-H), 1641, 1522, 1373 (m, υC=C, υC=N), 1079, 1032 (s, υC-O-C), 945 (w, υ=CH); MS (MALDI-TOF, CHCA做基質): 1339.32 (M+).

　　1.3 光譜實驗方法

　　固定菁染料-b-環糊精的濃度為2.15×10-5 mol/L，改變加入硫酸銅的濃度從0~2.14×10-3 mol/L，分別測定300.0nm～600.0nm範圍內，不同客體濃度下體係的紫外-可見光譜。結果見圖1。

　　圖1 Dye-b-CD在磷酸緩衝溶液(pH=7.2)中隨客體硫酸銅加入的吸收光譜變化

　　Fig. 1 UV-vis spectral changes of Dye-b-CD upon the addition of Chromium nitrate in NaH2PO4-Na2HPO4 buffer solution (pH=7.2).

　　1.4 包合配合物穩定常數的計算

　　假設菁染料-β-環糊精與硫酸銅之間形成了1:1的包結配合物，則主-客體分子間的包結配合作用如下式表示：

(1)

　　將主體(H)和客體(G)的初始濃度表示為[H]0和[G]0，則達到平衡時，主體、客體和包合配合物(HG)的平衡濃度可分別表示為[H]、[G]和[HG]，配位穩定常數Ks表示為：

(2)

　　在實驗中，保持客體濃度遠遠大於主體濃度，即[G]0>>[H]0，則上式可簡化為：

(3)

　　主客體包結配位前，吸光強度定為：

(4)

　　主客體包結配位達到平衡後，吸光強度定為：

(5)

其中 、 定義為吸光度敏感因子。

　　式(4)減去式(5)得到：

(6)

　　將式(6)帶入式(3)式將得到：

(7)

其中 為一常數，其數值與反應構象變化的程度有關。根據式(7)以 對

作圖，得到一條直線(如圖2所示)，由此得出硫酸銅與Dye-b-CD之間的包合比為1:1，根據直線的斜率和截距可以得到主客體配合物的穩定常數Ks和構象變化敏感因子 [14]。

　　2 結果與討論

　　菁染料-β-環糊精與硫酸銅相互作用紫外-可見光譜

　　圖1為Dye-β-CD與Cu2+相互作用的吸收光譜。從圖可以看出：Dye-β-CD的最大吸收波長隨Cu2+的加入沒有發生變化。Dye-β-CD與Cu2+形成的主-客體體係的吸光度值隨著Cu2+的不斷加入在不斷增加呈現出規律性的上升。這是這是因為在Dye-β-CD溶液中，發色團首先進入了b-環糊精的空腔，改變了發色團所處微環境，而使得體係吸光強度值增加;而當在溶液中加入Cu2+後，Cu2+能夠誘導發色團與β-環糊精空腔之間的幾何互補，即發色團與β-環糊精空腔之間發生更緊密的包結[13]，從而使得吸光度值進一步增加。

　　圖2是菁染料-b-環糊精與硫酸銅形成的體係中，體係吸光強度變化值(△A)與硫酸銅濃度之間的關係圖。

　　Fig. 2 Benesi-Hildebrand analyses for Dye-b-CD with Cr3+

　　根據圖2可得到改直線線性回歸方程：y=0.04757x+11.96920，R=0.79567，根據此方程，可得出硝酸鉻與Dye-b-CD之間的包合比為1，主客體配合物的穩定常數Ks為2.51×105 L/mol。

　　Fig. 3-12 UV-vis spectral changes of Dye-b-CD upon the addition of Cr3+ in NaH2PO4-Na2HPO4 buffer solution (pH=7.2)

　　圖3是Dye-β-CD分別與硫酸銅形成的體係中，體係吸光強度值的變化值(△A)與硫酸銅濃度變化的關係圖，根據呈現出良好線性關係，直線線性回歸方程為：y=0.0036x+0.0018，R=0.99388。因此，Dye-β-CD

　　能夠對溶液中的Cu2+含量進行檢測[15]。

　　3 結論

　　本文通過三步反應合成了一種菁染料-b-環糊精，產物的結構經1H NMR、IR、UV-vis和飛行質譜進行了表征。並研究了以其作為帶有熒光探針的主體化合物對Cu2+的識別作用。結果表明：菁染料-b-環糊精化合物是一種優良的帶有熒光探針的主體化合物，能夠對食品中銅含量進行有效的測定。若采用不同波段的半菁、菁染料對b-環糊精進行修飾，就可以得到適合的熒光探針，這類新型的主體化合物，本身帶有熒光探針功能，可使各種光譜手段，紫外-可見光譜、熒光光譜等方法廣泛應用於食品檢測分析研究。

　　(作者簡介：劉靜，1982年生，女，陝西富平人，陝西學前師範學院(原陝西教育學院)教師)

　　參考文獻：

　　[1] GOULD I R, LENHARD J R, MUENTER A A, et al. New approach to silver halide photography using radical cation chemistry[J]. Pure and Applied Chemistry, 2001, 73(3): 455-458.

　　[2] LEE C C, HU A I. Synthesis and optical recording properties of some novel styryl dyes for DVD-R[J]. Dyes and Pigments, 2003, 59(1): 63-69.

　　[3] PHAM W, MEDAROVA Z, MOOR A. Synthesis and application of a water-soluble near-infrared dye for cancer detection using optical imaging[J]. Bioconjugate Chem, 2005, 16(3): 735-740.

　　[4] YE Y-P, BLOCH S, KAO J, Achilefu S.Multivalent Carbocyanine Molecular Probes: Synthesis and Applications[J]. Bioconjugate Chem, 2005, 16(1): 51-60.

　　[5] LIU K-S, FU H-G, XIE Y et al. Assembly of β-Cyclodextrins Acting as Molecular Bricks onto the Multiwall Carbon Nanotubes[J]. J. Phys. Chem. C, 2008, 112(4): 951-957.

　　[6] Tedeschi T, Sforza S, Ye S, et al. Fast and easy colorimetric tests for single mismatch recognition by PNA-DNA duplexes with the diethylthiadicarbocyanine dye and succinyl-β-cyclodextrin[J]. J. Biochem. Biophys. Methods, 2007, 70: 735-741.

　　[7] Zhu X. S., Sun J., Wu J., Study on the inclusion interactions of β-cyclodextrin and its derivative with dyes by spectrofluorimetry and its analytical application[J]. Talanta, 2006, 10. 016.

　　[8] Yang Y., Yang H-F, Liu Y-L, et al. Cetyltrimethylammonium assay using fluorescence probe berberine and a competitive host-guest complexation with butylated β-cyclodextrin[J]. Sensors and Actuators B, 2005, 106: 632-640

　　[9] Esmaeili M. A., Yazdanparast R., Beta-cyclodextrin-boneded silica assists alkaline phosphatase and carbonic anhydrase refolding in a solid phase assisted refolding approach[J]. Process Biochemistry, 2010, 45: 239-246.

　　[10] WANG L-Y , LI F-M, HUANG Y, et al. Synthesis and Properties of Novel Hemicyanine Dyes-β-Cyclodextrin[J]. Chinese Journal of Chemistry, 2007, 25: 1192~1195.

　　[11] SONG Y, CHEN Y, LIU Y. Switchable fluorescence behaviors of pyronine Y at different pH values upon complexation with biquinolino-bridged bis(β-cyclodextrin)[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 2005, 173: 328-333.

　　[12] 黃耀東, 於海濤, 王永梅, 等. 苯並螺吡喃吲哚啉-β-環糊精的合成及性質[J]. 高等化學學報, 2001, 22(10): 1685～1687.

　　[13] 劉育, 張毅民, 戚愛棣, 等. 超分子體係中的分子識別研究[J]. 科學通報, 1998, 43(2): 166～168.

　　[14] 劉育, 尤長城, 張衡益. 超分子化學——合成受體的分子識別與組裝[M].天津: 南開大學出版社, 2001: 166～290, 528～534, 617～618.

　　[15] Zhu X. S., Sun J., Wu J., Study on the inclusion interactions of β-cyclodextrin and its derivative with dyes by spectrofluorimetry and its analytical application[J]. Talanta, 2006, 10. 016.