高效液相色譜法測定動物組織中5種磺胺類獸藥殘留檢測方法的探討

　　□ 劉海琴 鶴壁市畜產品質量監測檢驗中心

　　磺胺類獸藥是畜禽抗感染治療中的重要藥物，經過各種給藥途徑進入動物體內，使用不合理很容易在動物組織中造成殘留。近幾年來由於不科學和超量使用，殘留量也隨之加大，人們食用磺胺類藥物殘留超限量的畜禽產品，會出現急性或慢性中毒，影響人體的泌尿、免疫係統，破壞肌肉腎髒和甲狀腺等組織，如誘發人的甲狀腺癌等，還會導致人體內很多細菌對其產生耐藥性。對磺胺類藥物殘留的檢測原理主要是動物組織中磺胺類藥物經乙腈振蕩提取後，用堿性氧化鋁小柱淨化，注入高效液相色譜儀反向色譜係統中進行分離，用紫外檢測器檢測，與標準樣品峰麵積進行比較，外標法計算磺胺類藥物的含量。本文以豬肉樣品為例，談談有關磺胺殘留檢測的一些問題。

　　材料與方法

　　儀器與試劑

　　安捷倫1100液相色譜儀-配紫外，R-201旋轉蒸發儀，VX-2渦旋振蕩器,3-30k高速冷凍離心機，固相萃取裝置，堿性氧化鋁SPE小柱，乙腈(色譜級),甲醇(色譜級),冰乙酸(分析純)，正己烷(分析純),無水硫酸鈉(分析純),SMM，SM2，SMZ，SDM，SQ標準品純度≥99.7%(中國獸藥監察所提供)。

　　樣品前處理

　　試料製備與保存

　　從全部豬肉樣品中取出有代表性豬肉樣品約1kg，用勻漿機充分攪碎，均分成2份，分別裝入潔淨容器內，密封成為試樣，標明標記，於-18℃冷凍保存(臨用前解凍並恢複至室溫)。

　　提取溶劑、分離、淨化方式等

　　主要前處理過程

　　稱入樣品5.0g(精確至0.0001g)於具塞離心管中，加入5g無水硫酸鈉，加入15mL乙腈勻漿後，於渦旋震蕩器上4000r/min振蕩5min，5000r/min離心5min，上清液全部轉移至預先加入20mL正已烷的離心管中，試料中再加入15mL乙腈重複提取一次，離心後的上清液一同轉移至離心管中，振搖、靜置分層。取下層液，加入正丙醇5mL，50℃減壓至近幹。

　　堿性氧化鋁SPE柱臨用前用95%乙腈預洗，濃縮物用95%乙腈3mL溶解後過柱;再加95%乙腈5mL洗滌雞心瓶並將溶液過柱、擠幹，棄去過柱液。用70%乙腈10mL洗脫，洗脫液收集到雞心瓶中，擠幹，洗脫液加入5mL正丙醇，50℃減壓濃縮至幹，濃縮物用2.0mL流動相溶解，用微孔濾膜過濾，收集至進樣小瓶中，上機測定。

　　儀器設置

　　色譜條件：色譜柱：C18柱，250mm×4.6mmid;流動相∶乙腈∶甲醇∶水∶乙酸(2∶2∶9∶0.2);流動相流速：1.0mL/min;檢測波長：270nm;進樣量：20μL樣品一式兩份。

　　色譜分析：配製好的標準溶液與淨化後的樣品分別進樣，以保留時間定性，以樣品溶液峰麵積與標準溶液麵積比較外標法定量。

　　結果

　　定性：樣品中未知組分的保留時間(Rt)分別與標樣的保留時間(Rt)相比較，如果樣品中某組分的兩組保留時間與標準中某一藥物的兩組保留時間一致即可認定為該藥物。

　　計算：樣品中被測獸藥殘留量以質量分數w計，單位以毫克每千克(mg/kg)表示，按以下公式計算。

　　結果與討論

　　樣品加入乙腈後提取時間要充分，要將樣品中的磺胺類藥物溶解在乙腈試劑中，且樣品之間的提取時間盡可能一致，前者為提高回收率，後者為提高樣品之間的精密度，樣品提取液上柱(SPE柱)時，一定控製溶液流速，最好不大於10滴/min,如果流速過快,樣品中的磺胺類藥物不能夠完全吸附在SPE萃取柱,從而造成藥物流失.萃取柱的質量最關鍵,有的柱子活化時還沒有上樣就堵,或者在上樣的過程中堵得厲害,1～3min還沒有流1滴,這樣情況下,應該將其丟棄,重新做樣。

　　樣品在提取過程中，50℃減壓幹燥室一定注意負壓不能太高，否則，容易造成藥物隨著蒸氣流失，會使試樣處理液中磺胺濃度降低，濃度越低信號越弱，回收率也會相應降低。

　　陽性樣品回收率比較實驗：在5.0g豬肉樣品中分別添加5μg/mL磺胺類藥物混標溶液100μL,500μL按樣品前處理步驟處理和測定，濃度相當於含0.1mg/kg,0.5mg/kg的磺胺類藥物，測定結果顯示，豬肉中的回收率在90.36%～96.50%範圍內，標準偏差在0.58%～0.95%範圍之間，回收率高，且相同濃度下回收率穩定性好，低濃度的添加要普遍高於高濃度的添加。

　　如圖1、2(圖中1～5分別代表磺胺二甲基嘧啶，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺甲唑，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺喹啉)所示：磺胺二甲基嘧啶的出峰時間是5.762左右，磺胺間甲氧啶的出峰時間是7.553左右，磺胺甲唑的出峰時間是8.690左右，磺胺二甲氧嘧啶的出峰時間是16.776左右，磺胺喹啉的出峰時間是18.005左右。圖1是低濃度0.2μg/mL的色譜圖，圖2是高濃度1.0μg/mL的色譜圖，由圖可知，低濃度標準品的峰譜圖(圖1)受試劑峰(雜峰)的幹擾大，高濃度標準品的峰譜圖(圖2)則受試劑峰的幹擾較小。在做樣品過程種，由於樣品的藥物含量是未知的，需要配製由低到高梯度的標準品濃度，以滿足不同含量不同的樣品的計算，可以根據樣品含量的多少選擇相應的濃度點進行單點校正，或者繪製標準曲線，通過在曲線圖上查找，得到樣品相應的濃度。多點校正一般情況下確定(5～7個點)，濃度範圍是0.1～20.0μg/mL之間。

　　結論

　　實驗表明，豬肉經乙腈先後兩次得以充分提取，加入正己烷脫脂後濃縮、淨化後再濃縮，用流動相定容，采用高效液相色譜法C18色譜柱和紫外檢測器測定，一次進行5種磺胺類獸藥殘留測定。此方法操作簡單，單樣檢測時間約30min，樣品的提取也比較簡單，樣品加標回收率在90.36%～96.50%之間，標準偏差在0.58%～0.95%之間，適合動物組織中5種磺胺類藥物的大批量檢測。通過多年來經過對各類動物組織檢測的結果表明，該方法主要具有回收率高的特點，解決了藥物殘留提取不完全的問題，滿足市級檢測單位對動物組織中5種磺胺類獸藥殘留日常檢測需要。