HPLC法測定陝北地區甜菊葉中甜菊糖苷含量

祁春雷，劉月霞，高　強，文　鈺

(榆林合力生物科技有限公司，陝西榆林 719000)

摘　要：采用HPLC法測定陝北地區佳縣、定邊、米脂3個產地的甜菊葉樣品中甜菊糖苷含量。通過超聲提取得到甜菊葉中甜菊糖苷樣品液，使用高效液相色譜儀檢測甜菊糖苷樣品液。采用C18反相色譜柱(250.0 mm×4.6 mm，5 m)，流動相為乙腈-磷酸鈉緩衝液(30∶70，體積比)，梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，測定波長210 nm，進樣量10 μL。結果表明，HPLC法操作簡便、高效快速、穩定性好。

關鍵詞：甜菊葉;甜菊糖苷;高效液相色譜法

甜菊葉屬菊科，又名甜菊葉、甜草，是一種多年生草本植物，原產於南美洲巴拉圭巴西交界的阿曼山脈。甜菊糖是從甜菊葉中提取出的含甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B等9種甜味成分的四環二萜類化合物，其中，瑞鮑迪苷A甜菊苷含量最高，甜味品質最好，甜度是蔗糖甜度250～350倍，而熱量僅為蔗糖的1/300。2008年末甜菊糖被美國食品藥品管理局(FDA)批準使用，被譽為世界“第3類糖源”[1]。甜菊糖苷因其甜度高、熱量低、無毒性、耐高溫、耐酸堿和水溶性好，攝入人體後不被吸收，不產生熱量等優點，被稱為是天然、健康的新型無熱量代糖產品，是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。可用於糖果、糕點、飲料、固體飲料、油炸小食品、調味料和蜜餞等食品加工領域。

目前關於甜菊葉中甜菊糖苷的測定方法有質量法、堿量法、分光光度法和薄層色譜法等。本試驗擬采用高效液相色譜法對佳縣、定邊、米脂3個產地的甜菊葉樣品進行甜菊糖苷檢測，並分析甜菊葉裏甜菊糖苷混合物中不同甜菊糖苷的含量，以期為甜菊葉質量評價提供科學依據。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

3份相同品種甜菊葉樣品采於佳縣、米脂、定邊等地的農業企業或種植基地。乙腈、磷酸二氫鈉、磷酸，均為色譜純。磷酸鈉緩衝液(pH2.6)：稱取1.20 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，溶於800 mL水中，用磷酸調節pH至2.6。流動相：乙腈-磷酸鈉緩衝液(30∶70，體積比)。

甜菊苷標準品：甜菊苷含量(質量分數，以幹基計)≥99.0%。瑞鮑迪苷A標準品：瑞鮑迪苷A含量(質量分數，以幹基計)≥99.0%。其他7種糖苷標準品(質量分數，以幹基計)≥99.0%：瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊雙糖苷。

1.2　儀器與設備

高效液相色譜儀(日本島津公司產品);紫外檢測器;電子天平;超聲波清洗儀(上海傑理科技有限公司產品)。

1.3　實驗方法

1.3.1　色譜條件

C18反相色譜柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：乙腈：磷酸鈉緩衝液=30∶70，梯度洗脫，流速1mL/min;柱溫40 ℃;紫外檢測器波長為210 nm，進樣量10 μL。

1.3.2　標準品溶液製備

將甜菊糖苷標準品置於105 ℃幹燥箱中烘2 h，精密稱取5 mg，溶液溶解並定容至10 mL，搖勻置於棕色瓶中。即配成濃度為0.5 mg/mL的標準品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。吸取10 μL標液進樣，並記錄。

1.3.3　供試樣品溶液的製備

將3份甜菊葉樣品置於105 ℃幹燥箱中烘2 h，粉碎後分別稱取1 g放入燒杯中加入100 mL純淨水置於超聲波清洗器中60 ℃超聲提取1 h，高速離心20 min，收集過濾液並經0.45 μm微孔濾膜過濾，得到備用樣品。

2　結果與分析

2.1　精密度實驗結果

取上述佳縣供試樣品溶液連續進樣3次，進樣量為10 μL，記錄峰麵積，計算甜菊苷(Stevioside，ST)、瑞鮑迪苷A(Rebaudioside A，RA)、瑞鮑迪苷B(Rebaudioside B，RB)、瑞鮑迪苷C(Rebaudioside C，RC)、瑞鮑迪苷D(Rebaudioside D，RD)、瑞鮑迪苷F(Rebaudioside F，RF)、杜克苷A(DulcosideA，DA)、甜茶苷(Rubusoside，RUB)和甜菊雙糖苷(Steviolbiosid，SB)的相對標準偏差(Relative Standard Deviation，)值分別為2.15%、2.23%、1.98%、2.13%、2.02%、1.89%、1.99%、2.10%和2.11%，表明HPLC法測定甜菊糖苷含量精密度良好[2]。

2.2　甜菊葉中甜菊糖苷含量

佳縣、定邊、米脂甜菊葉中甜菊糖苷的色譜圖如圖1～圖3所示，具體含量見表1。甜菊葉中ST和RA含量占甜菊糖苷總量的比例是評價甜菊葉質量好壞的重要指標。表1結果顯示，3個地區的總苷含量在15.20%～17.51%，其中米脂的總苷含量最高，定邊的總苷含量最低[3]。不同地區各種成分含量差別比較大的是RA含量和RUB含量，其中，RA含量米脂最高、佳縣次之、定邊最低;RUB含量米脂最高、定邊次之、佳縣邊最低，米脂的RUB含量是佳縣的4倍[4]。

影響甜菊葉中甜菊糖苷含量的主要因素是溫度、光照、生長周期[5]。定邊甜菊葉種植在風力發電設備下，種植基地相對於佳縣和米脂海拔高、溫度低，導致甜菊葉的生長周期縮短，RA含量和總苷含量較低。而米脂種植基地在太陽能發電光板下，地勢平坦、溫度較其他兩地高，但光照不足，影響了甜菊葉的質量。佳縣是大麵積、大規模平地種植，正常光照和溫度，其RA占總苷含量最高。

3　結論

HPLC法測定甜葉菊中甜菊糖苷含量精密度良好，且能同時測定甜葉菊中甜菊糖苷總量及9種成分，包括甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷的含量，為不同地區甜葉菊質量評價提供了一種操作簡便、高效快速的檢測方法。

參考文獻

[1]羅慶雲,印敏,陳玉江,等.酸性氧化鋁前處理甜葉菊葉片甜菊糖苷分析樣品的質譜驗證[J].中國糖料,2019,41(4):24-29.

[2]安徽蚌埠惠農甜葉菊高科技發展有限公司.一種大量獲得甜葉菊葉片產物甜菊糖苷RM的方法:201810683979.5[P].2018-11-30.

[3]洪維廉,陳睦傳,李裏焜,等.甜葉菊甙研究的進展[J].植物科學學報,1987,5(3):211-218.

[4]明光市大全甜葉菊專業合作社.一種提高甜葉菊中甜菊糖苷含量的方法:106631356A[P].2017-05-10.

[5]鄧佐,夏延斌,王曉亮.簡易HPLC法測定甜菊葉中甜菊糖苷[J].農產品加工·學刊(下),2013(10):14-15.