不同水解時間對乳與乳製品中糠氨酸含量的影響

孫玉榮，胡冬梅*，劉 靜，楊文誌，王玉玨，江雲鵬

(蒙牛乳業(察北)有限公司 河北省張家口市張北縣察北管理區，河北張家口 076481)

摘 要：目的：探究水解時間對乳與乳製品中糠氨酸含量測定的影響。方法：在75 ℃、30 min及75 ℃、15 s殺菌條件下測定不同水解時間下乳與乳製品中的糠氨酸含量，探究其重複性與穩定性。結果：在75 ℃、30 min條件下，隨著水解時間的增加，乳與乳製品中糠氨酸含量有所增加。當水解時間為9.0 h，乳與乳製品中的糠氨酸含量達到最高，之後緩慢降低。乳與乳製品中的糠氨酸含量的加標回收率均>90%，相對標準偏差<6%。結論：不同水解時間會影響到乳與乳製品中的糠氨酸含量。

關鍵詞：糖氨酸;水解時間;檢測方法

Effect of Different Hydrolysis Time on Determination of Furosine Content in Milk and Dairy Products

SUN Yurong, HU Dongmei*, LIU Jing, YANG Wenzhi, WANG Yujue, JIANG Yunpeng

(Mengniu Dairy (Chabei) Co., Ltd., Chabei Administrative District Zhangbei County, Hebei Province, Zhangjiakou 076481, China)

Abstract: Objective: To explore the effect of hydrolysis time on the determination of furosine content in milk and dairy products. Method: Determine the content of furosine in milk and dairy products under the conditions of

75 ℃, 30 min and 75 ℃, 15 s under different hydrolysis time, and explore its repeatability and stability. Results: Under the condition of 75 ℃ and 30 min, with the increase of hydrolysis time, the content of furosine in milk and dairy products increased. When the hydrolysis time was 9.0 h, the content of furosine in milk and dairy products reached the highest, and then slowly decreased. The recovery rates of the addition of furosine content in milk and dairy products were both >90%, and the relative standard deviation was <6%. Conclusion: Different hydrolysis time will affect the content of furosine in milk and dairy products.

Keywords: glycine; hydrolysis time; detection method

糠氨酸是牛乳在加熱過程中，氨基酸、蛋白質與乳糖通過美拉德反應生成ε-N-脫氧乳果糖基-L-賴氨酸(ε-N-deoxylactolusy-L-lysine)，經酸水解轉換成更穩定的糠氨酸(ε-N-2-furoylmethyl-L-lysine，ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸)[1]。這個反應的大小程度與生乳在滅菌過程中熱處理的類型與強度有著密切的聯係，與成品液態奶品質的優良息息相關。

《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中複原乳的鑒定》(NY/T 939—2016)中糠氨酸含量的測定：試樣經鹽酸水解後測定蛋白質含量，水解液經稀釋後用高效液相色譜(HPLC)或超高效液相色譜(UPLC)在紫外(波長280 nm)檢測器下進行分析，外標法定量[2]。基於水解時間要求(110±2)℃下加熱水解12～23 h。

因耗時較長的原因，本文分析研究水解1～13 h的糠氨酸的回收率，並進行回收率試驗，對比分析1～13 h的糠氨酸檢測數據。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

甲醇(CH3OH)：色譜純;濃鹽酸(HCL，密度為1.19 g/mL);三氟乙酸：色譜純;乙酸銨;糠氨酸(C12H17N2O4·XHCL);水相濾膜;水相針頭式濾器;1 mL注射器。

1.2 儀器

配有紫外檢測器的高效液相色譜儀;(110±2)℃幹燥箱;密封耐熱試管：容積為20 mL;電子天平：感量為0.1 mg;凱氏定氮儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣

用於檢測的巴氏殺菌乳在儲存和運輸過程中的溫度為2～6 ℃，UHT滅菌乳儲存和運輸溫度不高於25 ℃。按《隨機數的產生及其在產品質量抽樣檢驗中的應用程序》(GB/T 10111—2008)的規定取不少於250 mL樣品，樣品在送檢過程中應完好無損且樣品儲存環境條件符合要求。

1.3.2 試樣水解液的製備

吸取2.00 mL試樣，置於密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，混勻。密閉試管，置於幹燥箱中，在110 ℃下加熱水解1～13 h，加熱約1 h後，輕輕搖動試管。在加熱結束後，將試管從幹燥箱中取出，冷卻後用濾紙過濾，濾液供測定[2]。

1.3.3 試樣水解液中蛋白質含量的測定

移取2.00 mL試樣水解液，按《世界杯賽程預測國家標準 食品中蛋白質的測定》(GB 5009.5—2016)的規定測定試樣溶液中的蛋白質含量[3]。

1.3.4 糠氨酸含量的測定原理

試樣經鹽酸水解後測定蛋白質含量，水解液經稀釋後用高效液相色譜(HPLC)或超高效液相色譜(UPLC)在紫外(波長280 nm)檢測器下進行分析，外標法定量。

1.3.5 試樣水解液中糠氨酸含量測定

移取1.00 mL試樣水解液，加入5.00 mL的6 g/L乙酸銨溶液，混勻，過0.22 μm水相濾膜，濾液供上機測定。

1.3.6 HPLC測定

(1)色譜參考條件。色譜柱：CAPCELL PAK C18 TYPE：AQ 250 mm×4.6 mm，5 μm粒徑;柱溫：32 ℃;流動相：0.1%三氟乙酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B;洗脫梯度，見表1。

(2)糠氨酸含量測定。利用流動相A和流動相B的混合液(50∶50)以1 mL/min的流速平衡色譜係統。然後，用初始流動相平衡係統直至基線平穩。空白試劑為10 µL鹽酸溶液(濃度3 mol/L)，選擇10 μL待測溶液對糠氨酸含量進行測量。

其 中：X- 試 樣 中 蛋 白 質 的 含 量，g/100 g; V1- 試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL;V2-試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL;C- 硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L;0.014 0-1.0 mL硫酸[(c ½H2SO4)=1.000 mol/L]或鹽酸[(c HCl)=1.000 mol/L] 標準滴定溶液相當的氮的質量，g;m- 試樣的質量，g;V3- 吸取消化液的體積，mL;F- 氮換算為蛋白質的係數，各種食品中氮轉換係數;100- 換算係數。

(4)糠氨酸含量的計算。糠氨酸含量以質量分數計，數值以毫克每百克蛋白質(mg/100 g蛋白質)表示，糠氨酸含量的計算如(2)所示：

2 結果與分析

2.1 樣品中糖氨酸含量(mg/100 g蛋白質)

標樣的濃度為2 mg/L，以標樣的峰麵積為儀器采集數據，對樣品中糖氨酸的含量進行計算。樣品在乳糖酶作用下，牛乳水解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h，采用HPLC法對牛乳中糠氨酸含量進行測量。作為MailIard反應產生的特定產物，糠氨酸近年來常常被用於食品受熱程度的判斷與評估，主要應用在穀物、蛋類、肉製品及中藥口服液中。由表2可知，隨著乳糖酶水解時間的延長，乳與乳製品中糠氨酸含量呈現升高趨勢。經過75 ℃、30 min及75 ℃、15 s預殺菌處理條件下，可以發現其前者較後者所獲得的糠氨酸含量成倍升高。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中複原乳的鑒定》要求，其中的糠氨酸含量>12 mg/100 g蛋白質或UHT乳中糠氨酸含量>190 mg/100 g 蛋白質，表示含有複原乳。當水解時間達到9 h後，乳與乳製品中糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白質，隨著水解時間的延長，糠氨酸含量逐漸降低。乳與乳製品經過75 ℃、15 s熱處理，糠氨酸含量較低，相當於有複原乳的巴氏殺菌乳。

2.2 加標回收率試驗

在已知糠氨酸含量供試驗品中加入一定量標準樣品，反複進行5次測定，結果如表3所示。

由表3可知，其回收率均在90%以上。按照公式計算相對標準偏差，結果為：

3 結論

本文對《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中複原乳的鑒定》分析步驟中的試樣水解液的製備[3-4]，水解時間在9 h的糠氨酸含量回收率進行分析論證得到，樣品的回收率結果符合回收率要求90%～110%(高效液相色譜法測定複原乳中糠氨酸的含量回收率試驗)[5]，相對標準偏差為5.68，符合獨立測試結果<10%的要求。隨著乳糖水解時間的延長，乳與乳製品中糠氨酸含量呈現出升高趨勢，當水解時間為9 h且經過75 ℃、30 min熱處理，糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白質，乳與乳製品相當於含有複原乳的UHT殺菌乳，在75 ℃、15 s條件下，乳與乳製品獲得糠氨酸含量少，僅為含有複原乳的巴氏殺菌乳。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中複原乳的鑒定》製備試樣水解液，將水解時間控製為9 h，獲得的糠氨酸含量最高，且具有較高的回收率，標準偏差<10，故可應用於實際的檢測工作中，節約人工成本、提高工作效率。

參考文獻

[1]許國慶,趙慧芬,李克傑,等.乳與乳製品中糠氨酸含量的測定方法[J].中國奶牛,2006(7):44-46.

[2]遲驍瑋.乳品中糠氨酸定量分析及熱處理對糠氨酸含量影響的研究[D].淄博:山東理工大學,2012.

[3]盧沛明,黃娟.乳製品中的糠氨酸測定方法的改進[J].食品科技2015,40(7):318-320.

[4]王峰恩,張養東,鄭楠,等.奶及奶製品中糠氨酸檢測方法的研究進展[J].世界杯賽程預測質量檢測學報,2021,12(6):2304-2312.

[5]陳衝衝,鄭楠,文芳,等.牛奶中糠氨酸檢測方法的研究進展[J].中國乳品工業,2017,45(4):25-29.