高效液相色譜-質譜法檢測水產品中硝基呋喃及其代謝物的研究

高效液相色譜-質譜法檢測水產品中硝基呋喃

及其代謝物的研究

劉 薇*，尚 勇

（南昌市檢驗檢測中心農產品檢測分中心，江西南昌 330009）

摘 要：采用超高壓液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）檢測了水產品中呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥因（AHD）和呋喃唑酮（AOZ）4種硝基呋喃代謝物的殘留量。樣品用鹽酸溶液水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，采用乙酸乙酯液-液萃取淨化，初始流動相複溶後，經C18液相色譜柱分離，ESI電離源串聯三重四級杆質譜儀以多反應監測掃描模式（MRM）進行檢測分析，內標法定量。結果表明，平均回收率在97.77%～99.75%，相對標準偏差（RSD）在0.4%～7.3%，定量結果準確，精密度好，測定結果能夠滿足實驗室對批量化水產品硝基呋喃代謝物殘留的檢測要求。

關鍵詞：水產品；硝基呋喃類代謝物；超高壓液相色譜-串聯質譜

自從1944年M.C.Dodd和W.B.Stillman發現5-硝基呋喃衍生物有抑菌作用後[1]，大量的硝基呋喃類藥物被合成並廣泛運用於醫學和畜禽水產養殖等領域。因為其價格低且效果好，曾在水產養殖中廣泛用於預防和治療由革蘭氏細菌引起的水產動物胃腸道疾病[2]。但研究表明，硝基呋喃類藥物具有嚴重的致癌、致畸胎等毒副作用[3]。我國農業部於2002年12月24日發布的第235號公告及2005年10月28日發布的第560號公告中，硝基呋喃類藥物被列為飼養過程中的禁用藥物，在動物性食品中不得檢出[4]。目前，全球大多數國家已將其列為禁用藥物，水產品中硝基呋喃類藥物的檢測方法也很多，但因液相色譜-串聯質譜法能夠充分發揮超高效液相色譜的高分離度、高速以及串聯質譜的高特異性和高靈敏度的作用，在水產品檢測硝基呋喃時尤為常用[5]。本試驗采用內標法定量，回收率較高且結果穩定，適用於實驗室批量處理水產品硝基呋喃類代謝物的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

三重四級杆液相色譜質譜聯用儀API 4000+（AB SCIEX 公司）；超高效液相色譜儀LC-30A（日本島津公司）；pH計（美國奧豪斯上海公司）；空氣搖床（上海喆圖科學儀器）；電子天平（上海舜宇科學儀器有限公司）。

1.2　材料與試劑

AHD標準品（德國WITEGA實驗室，100 μg/mL）；SEM標準品（德國WITEGA實驗室，100 μg/mL）；AOZ標準品（德國WITEGA實驗室，100 μg/mL）；AMOZ標準品（德國WITEGA實驗室，100 μg/mL）；AHD-13C3標準品（曼哈格，99.5%）；SCA-HCl-13C，15N2標準品（曼哈格，98.7%）；AOZ-D4標準品（曼哈格，98.7%）；AMOZ-D5標準品（曼哈格，99.5%）；二硝基苯甲醛（東京化成工業株式會社）；二甲亞碸（東京化成工業株式會社）；乙酸乙酯（霍尼韋爾）；正己烷（霍尼韋爾）；磷酸氫二鉀（分析純）；鹽酸（分析純）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配置

準確稱取4種硝基呋喃代謝物標準品用甲醇配置成

1 mg/mL的AMOZ、AOZ、SEM、AHD標準儲備液。使用前準確吸取4種標準儲備溶液，用水逐級稀釋成100 ng/mL和10 ng/mL的混合溶液，4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品的處理

稱取2.0 g陰性草魚肉樣品置於50 mL離心管中，再加入50 μL混合內標溶液（100 ng/mL）、10 mL鹽酸

（0.2 mol/L）、300 μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦旋混勻1 min，置於避光、37 ℃空氣搖床中衍生16 h。取出樣品，加入約5 mL磷酸氫二鉀，調節pH值7.0～7.5，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩提取5 min，9 000 r/min離心5 min，提取全部上清液置於無刻度試管中，再加入10 mL

乙酸乙酯重複一遍，合並上清液於40 ℃下氮氣吹幹。往吹幹的試管中加入1.0 mL的0.1%甲酸水溶液+乙腈（9∶1），渦旋溶解，加入3 mL乙腈飽和的正己烷兩次液液分配，去除脂肪，下層水相過0.22 μm濾膜後裝瓶。另取陰性草魚肉樣，分別加入硝基呋喃類標準品，使添加濃度分別為

0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、8.0 μg/L和12.0 μg/L，每個濃度做6個平行，進行回收率試驗。

1.3.3 高效液相色譜-串聯質譜條件

島津C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫40 ℃，進樣量10 μL，流速0.2 mL/min。流動相梯度洗脫條件見表1。質譜條件為電噴霧離子源（ESI），采用正離子掃描，檢測方式為多反應監測，相關參數見表2。

2 結果與分析

2.1 硝基呋喃代謝物的標準曲線和檢測方法的靈敏度

按上述條件測定係列質量濃度的4種硝基呋喃代謝物混合標準溶液，繪製標準工作曲線，硝基呋喃代謝物的線性方程和相關係數見表3。結果表明，4種硝基呋喃代謝物在0.5～12 ng/mL呈線性關係。

2.2 回收率和精密度試驗

AMOZ、SEM、AHD及AOZ代謝物的回收率分別為84.4%～106.1%、92.5%～102.7%、93.9%～109.5%及93.1%～103.7%。相對標準偏差（RSD）在0.4%～7.3%。方法的回收率與精密度完全可以滿足批量檢測出具報告的要求，試驗結果見表4.

3.結論

研究建立了測定水產品中硝基呋喃類代謝物的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，相對回收率為97.8%～99.8%，相對標準偏差為0.4%～7.3%，檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。運用經過優化後的方法得出的實驗結果穩定、可靠，不僅能夠提高樣品處理效率，而且能夠較好地解決陽性樣品檢測值偏低的問題。實驗表明，本方法定量分析準確，精密度好，應用於實際樣品的檢測取得了滿意結果，適合於快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物。

參考文獻

[1]ALI BH.Pharmacological,therapeutic and toxicological properties of furazolidone: some recent research[J].Veterinary Research Communications,1999,23(6):343-360.

[2]徐偉,耿士偉,劉路,等.硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測方法的研究進展[J].天津農業科學,2018,24(8):16-20.

[3]NOUWS J F,LAURENSEN J.Postmortal degradation of furazolidone and furaltadone in edible tissues of calves[J].The Veterinary Quarterly,1990,12(1):56-59.

[4]中華人民共和國農業部.中華人民共和國農業部公告第235號[Z].2002-12-24.

[5]高月明,馮笑軍,李倩瑩.超高效液相色譜-串聯質譜法測定淡水魚中硝基呋喃類代謝物殘留[J]. 世界杯賽程預測質量檢測學報,2017,8(8):3231-3236.