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QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中的氯黴素類獸藥殘留

2021-11-29 14:07:44 來源:

QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中的氯黴素類獸藥殘留
何 江
（貴陽市農產品質量安全監督檢驗測試中心，貴州貴陽 550081）
作者簡介：何江（1984—），男，漢族，貴州織金人，碩士，高級農藝師。研究方向：食品檢測和質量安全。
摘 要：目的：建立了QuEChERS方法結合高效液相色譜-串聯質譜測定雞蛋中氯黴素類獸藥殘留分析方法。方法：雞蛋樣品以80%乙腈水提取，加入鹽析劑處理，取上清液經C18淨化，UPLC-MS/MS測定。結果：目標化合物在0.010～0.100 µg/mL濃度範圍內線性關係良好，相關係數R≥0.991，檢出限和定量限分別為0.505～0.750 µg/kg和1.683～2.500 µg/kg。在0.01 mg/kg添加水平下，氟苯尼考胺、氯黴素、氟甲碸黴素的平均加標回收率範圍在76.5%～108.0%，相對標準偏差（RSD）範圍在5.33%～6.01%。結論：本方法快速、簡便、準確，可用於雞蛋中氯黴素類藥物的殘留測定。
關鍵詞：QuEChERS；超高效液相色譜-串聯質譜；雞蛋；氯黴素
雞蛋營養豐富，富含優質蛋白質、維生素和礦物質等，是餐桌上常見的食品。氯黴素類抗生素具有廣譜性，能有效治療動物疾病。但是，氯黴素存在嚴重的毒副作用，如能抑製人體骨髓造血功能，引起人體的再生障礙性貧血，粒狀白細胞缺乏症[1]。由於氯黴素類藥物價格低廉，療效好，在畜禽養殖過程中會殘留在雞蛋中，對人們的健康和環境構成嚴重危害，我國已經明確規定氯黴素不得在雞蛋中檢出[2]。
QuEChERS前處理方法具有快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全等特點，是近年來應用廣泛的樣品前處理技術，常常用於獸藥殘留分析。氯黴素類藥物的測定方法主要有氣相色譜法[3]、氣相色譜-質譜法[4]、液相色譜-串聯質譜法[5]等，其中超高效串聯質譜法具有分析速度快和靈敏度高的特點。本研究在QuECHERS方法的基礎上，對提取溶液種類和淨化劑含量等參數進行了優化，結合UPLC-MS/MS測定，建立了一種快速、有效、簡便的測定雞蛋中氯黴素類藥物的方法。
1 試驗部分
1.1 儀器與試劑
儀器：MixOne數顯渦旋振蕩器（合肥艾本森科學儀器有限公司）；高速離心機（日本Hitachi Limited公司）；FSH-2可調高速電動勻漿機（上海天由儀器科技有限公司）；Milli-Q超純水淨儀（美國Millipore公司）；超聲波清洗器（浙江納德科學儀器有限公司）；Waters XEVO MS超高效液相串聯質譜儀（美國Waters公司）。
試劑：氯黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標準品溶液
（100 µg/mL）（北京壇墨質檢科技有限公司）；乙腈、甲酸和甲醇（HPLC級，美國德國MERCK公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水；十八烷基鍵合矽膠填料（C18）和石墨化炭黑（GCB）（美國Agilent公司）。
1.2　試驗方法
1.2.1 標準溶液配製
分別吸取濃度為100 µg/mL標準溶液（氯黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺），用甲醇配製成濃度為2.0 µg/mL的混合標準儲備液。準確吸取適量混合標準儲備液，用空白提取液稀釋成濃度為0.01 µg/mL、0.02 µg/mL、0.04 µg/mL、
0.08 µg/mL和0.10 µg/mL的基質混合標準溶液，流動相（甲醇∶水=10%∶90%）稀釋成濃度梯度為同係列濃度的溶劑混合標準溶液。
1.2.2 樣品前處理
稱取雞蛋樣品2.00 g（精確至0.01 g）置於50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈-水（8∶2，V/V）（含0.1%甲酸）提取，高速勻漿，靜置5 min，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，劇烈振蕩3 min後，超聲提取10 min，10 000 r/min離心
10 min，取上清液於5 mL離心管中，加入10.0 mg固相萃取填料C18進行淨化，10 000 r/min離心10 min，過0.22 µm濾膜後，UPLC-MS/MS測定。
1.2.3 色譜條件
色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流動相：A為0.1%（V/V）甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～3 min，20% B；3～5 min，80% B；5～
8 min，100% B；8～10 min，10% B。流速：0.2 mL/min；進樣量：5 µL。
1.2.4 質譜條件
離子源：電噴霧電離源（ESI）；負離子模式掃描（氟苯尼考胺為正離子模式）；多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：3.5 kV，離子源和離子化溶劑溫度分別為150 ℃和500 ℃，離子化和錐孔氣體流量分別為1 000 L/h和50 L/h。質譜參數見表1。
2 結果與討論
2.1 提取溶劑的選擇
本研究考察了6種提取溶劑的提取效果，分別為90%甲醇水、80%甲醇水、70%甲醇水、90%乙腈水、80%乙腈水和70%乙腈水。結果表明，含有甲醇組的提取液色素幹擾嚴重，蛋白沉澱效果差，影響目標物提取，回收率均在60%以下。乙腈組織滲透力和沉澱蛋白質能力強，本試驗選取乙腈作為提取溶劑。提取劑中加入水的含量對目標物氟苯尼考胺的提取有顯著影響，其中提取劑中含水量為10%和20%時，氟苯尼考胺回收率無差異，當提取劑中含水量下降到30%時，氟苯尼考胺的回收率從90%下降為50%。為了減少有機溶劑乙腈的用量，節約成本，因此，選擇乙腈-水（8∶2，V/V）為提取溶劑，提取回收率在76.5%～108%，按照GB/T 27404—2008準確度要求，該方法滿足農藥殘留檢測的要求。
2.2 淨化劑的選擇
C18可以去除提取液中非極性物質，降低幹擾和減小基質效應，提高分析結果的準確性和重現性；GCB可以消除色素對試驗結果的幹擾和質譜離子化的影響。本文分別考察了加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的C18加入量對目標物的影響。研究證明C18為20 mg，添加濃度為0.01 mg/kg時，氯黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率範圍在76.5%～108%。同時，當在20 mg C18中加入
20 mg GCB時，氯黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收範圍為75.6%～92.4%，為了節約成本和減少試驗步驟，本研究選擇不加GCB。因此，本研究選擇淨化劑為C18，添加量為20 mg。
2.3 色譜-質譜條件選擇及優化
在相同梯度洗脫條件下，考察了流動相甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對氟苯尼考胺、氯黴素和氟甲碸黴素的分離度、靈敏度和峰型的影響。試驗表明，以乙腈水體係為流動相時，氟苯尼考胺保留時間小於
0.5 min；以甲醇水體係作為流動相時，氟苯尼考胺能有效保留，保留時間為1.27 min，本研究選擇洗脫能力弱的甲醇體係，圖1為氯黴素類藥物在甲醇體係的MRM色譜圖。
氯黴素類藥物用甲醇配製成濃度為200 µg/L，質譜注射泵直接進入質譜進行MS掃描，優化毛細管電壓尋找母離子；優化碰撞能量，選擇響應高和幹擾小的子離子作為定量離子。電離模式、定量離子對、定性離子對、碰撞能量及錐孔電壓見表1。
圖1 氯黴素類藥物的MRM色譜圖
2.4 基質效應、檢出限和定量限
配製基質匹配混合標準溶液，UPLC-MS/MS進行檢測。在0.010～0.100 µg/mL範圍內溶劑和基質匹配標準曲線的線性相關係數R≥0.991。以定量離子的信噪比S/N=3和S/N=10分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[6]，氯黴素類化合物在雞蛋基質中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.505～0.750 µg/kg和1.683～2.500 µg/kg，結果見
表2。
在UPLC-MS/MS檢測複雜樣品時，易受樣品基質的幹擾，影響目標物的離子化，產生增強或抑製效應，稱為基質效應（Matrix Effect，ME）[7]。基質效應=基質匹配校準曲線的斜率／溶劑標準校準曲線的斜率，比值越接近1，則基質效應越小；比值在0.8～1.2範圍內，則表明基質效應不明顯。基質效應見表2，除氟苯尼考胺外，氯黴素和氟甲碸黴素在雞蛋中基質效應較為明顯，因此采用空白基質匹配標準曲線以降低基質效應的影響。
2.5 回收率與精密度
選擇空白雞蛋樣品，在0.01 mg/kg添加水平下，進行6次平行試驗。采用基質匹配標準曲線進行定量分析，氯黴素類藥物在雞蛋基質中的回收率與相對標準偏差結果見表3。氟苯尼考胺、氯黴素、氟甲碸黴素的平均加標回收率範圍在76.5%～108.0%，相對標準偏差（RSD）範圍在5.33%～6.01%，符合《實驗室質量控製規範 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[8]。
2.6 實際樣品測定
隨機選取超市和養殖場的動物源性食品，包括超市雞蛋12份和養殖場21份，共33份樣品，運用所建立的方法對樣品進行檢測，同時做方法對比，運用國標方法《動物源性食品中氯黴素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）[9]。結果顯示，所測的33份雞蛋樣品均未檢出氟苯尼考胺、氯黴素和氟甲碸黴素。
3 結論
本文利用QuEChERS方法結合超高效液相色譜-三重四極杆質譜法，建立了雞蛋樣品基質中氯黴素獸藥殘留的測定方法。該方法快速、簡便、靈敏，能夠對樣品中的目標化合物進行準確的定性和定量分析，采用基質匹配校正曲線定量，能最大程度地消除基質幹擾，使檢測結果更加精確，適用於動物源性食品雞蛋中獸藥殘留的快速檢測。
參考文獻
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[2]崔榮飛,趙興鑫,田梅,等.動物源性食品中非法添加物殘留危害及檢測技術[J].今日畜牧獸醫,2019,35(12):1-3.
[3]郭軍,王文蘭,趙全東,等.氣相色譜法測定水產品中氯黴素殘留的不確定度評定[J]. 世界杯賽程預測質量檢測學報,2018,9(23):6216-6220.
[4]張春輝.氣相色譜質譜法同時測定動物組織中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺及氯黴素[J].企業科技與發展,2020(9):79-81.
[5]黃建芳.QuEChERS/高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大黃魚中五氯酚及氯黴素類藥物殘留[J].現代食品,2020(21):170-173.
[6]郭學桃.化學檢測中檢出限的測定與運用[J].大眾標準化,2018(5):42-45.
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[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.實驗室質量控製規範 食品理化檢測GB/T 27404—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.
[9]國家質量監督檢驗檢疫總局.動物源性食品中氯黴素類藥物殘留量測定GB/T 22338—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.
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