瘦肉精的預處理和檢測方法研究進展

王晗瑜，王慧利，李捷意，王學東*

(蘇州科技大學環境科學與工程學院，江蘇蘇州 215009)

摘　要：瘦肉精是一類人工合成的β-腎上腺素激動劑，常被用作治療支氣管哮喘，因具有顯著的合成代謝作用，往往被非法用作飼料添加劑。尤其是鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和氯丙那林等，能夠增強肌肉質量，減少體脂。這類激動劑會在動物體內殘留，從而通過動物對人體造成損害。本文就瘦肉精類藥物常規監測方法中的預處理步驟和檢測方法兩方麵，總結了其基本原理、操作過程、優缺點、研究進展等，並指出了目前存在的問題及在檢測方麵未來的發展方向。

關鍵詞：瘦肉精;克倫特羅;萊克多巴胺;預處理;檢測方式

瘦肉精又名鹽酸克倫特羅，是一類人工合成的β-腎上腺素激動劑。它本是治療支氣管哮喘的藥物，但由於其能夠促進瘦肉生長，抑製肥肉生長，往往被不法養殖戶用作飼料添加劑。傳統的瘦肉精包括鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CLB)、萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)、沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)等。該類藥物的半衰期長，在體內代謝較慢，極易在動物體內蓄積，人食用後容易出現惡心、頭暈、肌肉震顫、心悸等中毒病症，嚴重影響消費者的身體健康，近年來，許多國家如中國、俄羅斯、歐盟和日本，已經禁止在牲畜中使用瘦肉精，而在其他幾個國家被允許使用，如美國、澳大利亞、加拿大、墨西哥和巴西。

目前瘦肉精主要的檢測方法分為酶聯免疫法、膠體金試紙法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-串聯質譜法等。酶聯免疫法是當前用來檢測家畜飼料、尿液中的瘦肉精最為普遍、快速的方法。氣相色譜-質譜聯用法簡單、靈敏、具有可重複性，但是常常需要複雜的步驟增加目標物的揮發性，分析物不穩定且分析耗時較長。液相色譜-質譜聯用法具有專一性強、靈敏度高，但是儀器昂貴，檢測人員專業性強，成本高，一般農貿市場很難普及。豬肉的基質較為複雜，在分析前需要對分析物進行額外的預處理淨化除脂。常用的預處理方法有固相萃取技術、分散液相微萃取技術、液-液萃取技術、固相微萃取技術等。

1　預處理

1.1　固相萃取法

固相萃取技術是樣品前處理技術中應用較為廣泛的一種，用於樣品的分離和淨化，可大大提高檢測的靈敏度。這種前處理技術相對於液-液萃取，能夠避免由於受基質幹擾而產生的乳化現象和萃取不完全導致的回收率較低問題，並且還能避免有機溶劑消耗，產生大量的廢液，可自動化批量處理並且重現性好。但同時也存在一些缺點，前處理步驟煩瑣，耗時長，使用進口固相萃取小柱成本較高且需要專業人員協助進行方法開發等。陳海玲[1]等用MCX固相萃取柱淨化，測定了豬肝樣品中的RAC，在0.5 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg添加的樣品中，獲得的平均回收率為82.0%～102.0%，相對標準偏差均<4%。此類研究運用固相萃取技術都取得了令人滿意的檢測效果。

1.2　液-液萃取

液-液萃取是最常用的液體樣品萃取技術之一，它涉及到互不相溶的兩相溶劑，利用待測物在兩相中具有不同的親疏性而達到分離的目的。在液-液萃取操作過程中一相通常為水相，而另一相為有機溶劑。親水性強的化合物進入極性的水相多，而疏水化合物將主要溶於有機溶劑中。萃取進入有機相的被測物經溶劑揮發容易回收，而提取進入水相中的被測物經常能夠直接注入反相液相色譜柱中分析。但液-液萃取耗時長，需要使用大量的有機溶劑，尤其是高純度的有機溶劑，這些試劑具強揮發性，且還具乳化現象，造成萃取劑和水體的分離困難。

1.3　分散液相微萃取

分散液相微萃取是2006年首次開發的一種快速、簡單、方便、經濟的預處理方法，已經應用於人體尿樣中精神類藥物和水體中多種農藥殘留的測定，但是在獸藥殘留方麵的研究不多。該方法集采樣、萃取和濃縮於一體，是一種操作簡單、快速、成本低、富集效率高且對環境友好的樣品前處理新技術。但該方法的明顯缺陷是隻能應用於樣品基質相對簡單的水樣分析，在固體樣品中不能直接使用。

1.4　固相微萃取法

固相微萃取的萃取方式有兩種：一種是將石英纖維直接插入試樣中進行萃取，適用於氣體與液體中的組分分析;另一種是頂空萃取，適用於所有基質的試樣中揮發性、半揮發性組分分析。該萃取方法具有操作方便、耗時短、不會對環境造成汙染、儀器簡單、易操作和靈敏度高等優點。但該方法價格昂貴、普適性不高，對目標化合物的回收率和精密度均低於液液萃取法。

2 檢測方法

2.1　HPLC-MS檢測

采用HPLC-MS檢測肉樣中的瘦肉精時，需要進行樣品預處理。羊肉在分析前保持冷凍狀態，切碎勻質後，取等分試樣進行提取和淨化。將醋酸緩衝溶液和β-葡萄糖苷酶添加到2.3 mL勻化的等分試樣中，經過酶水解後，調節樣品的酸堿度，離心，然後將SPE柱用甲醇和水進行活化，取上清液過柱，用2 mL水和2 mL乙酸鹽緩衝溶液分別洗滌，並在真空下幹燥。最後用甲醇進行最後一次洗滌，二氯甲烷和氨洗脫，洗出液蒸發至幹，甲酸水溶液溶解，過濾膜後上機測定。張絜青[2]等采用該方法測定豬肉中的CLB，結果此方法檢出限達到0.01 μg/kg，回收率為78.5%～98.6%。

2.2　HPLC檢測

將精細均質的豬肉等分試樣轉移到50 mL錐形玻璃燒瓶中，加入乙酸鈉和β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶並混合，以5 000 rpm離心10 min，取上清液轉移到50 mL燒瓶中，用5 mL乙酸鈉洗滌組織殘餘物，然後將高氯酸添加到上清液中，調節高氯酸的酸堿度。混合液再以5 000 r/min離心

10 min，將上清液轉移到另一個50 mL離心管中，用NaOH將溶液調至強堿性(pH=11)。混合物用10 mL飽和氯化鈉溶液和乙酸異丙醇乙酯的混合溶液完全萃取。將有機相轉移到另一個離心管中，在溫和的氮氣流下幹燥，用含有0.1%甲酸的甲醇/水定溶至1.0 mL，用於HPLC檢測。HPLC涉及到多種檢測器，常用的有紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器3種。

2.2.1　紫外檢測器(HPLC-UV)

紫外吸收檢測器(UV)是基於朗伯-比耳定律，根據被測組分對紫外光或可見光的吸收及吸收強度與組分濃度成正比的關係進行檢測。具有應用廣泛、靈敏度高、線性範圍寬、對流動相的溫度和流速變化不敏感及適合梯度洗脫等優點。但具有隻能用於檢測紫外吸收光的部分，溶劑要選無紫外光吸收的物質，紫外光不透過的溶劑不能檢測。KUNPING[3]等人采用HPLC-UV法快速篩選豬肉樣品中SAL、CLB和RAC，線性範圍為0.2～50 μg/L，相關係數2為0.99，相對標準偏差<3%，檢出限<0.05 μg/L。

2.2.2　光電二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)

DAD是一種具有更高分析性能的檢測器，由1 024個光電二極管陣列組成，每個光電二極管寬僅50 μm，各檢測一窄段波長。在檢測器中，光源發出的紫外或可見光通過HPLC流通池，在此流動相中的各個組分進行特征吸收，然後通過狹縫，進入單色器進行分光，最後得到各個組分的吸收信號，經計算機快速處理，得到三維立體譜圖。金雁[4]等應用HPLC-DAD檢測器同時測定CLB、SAL、OTC、TE，結果表明，CLB和SAL的線性範圍為0.04～10 μg/mL，平均回收率為70.3%～94.3%，相對標準偏差為1.52%～5.85%;OTC和TE的線性範圍為0.5～

10 μg/mL，平均回收率為64.1%～94.2%，相對標準偏差為1.23%～4.53%。

2.3　GC-MS檢測

與HPLC-UV相比，GC-MS檢測更加快速、準確和靈敏，但其需要樣品衍生化步驟，因為像CLB類的β-腎上腺素激動劑含有-OH、-NH2或-COOH等類似的極性基團，具沸點高、難揮發等特點，所以GC-MS檢測多采用衍生化試劑用來改變樣品的這些極性基團，使樣品成為極性低、可氣化的衍生分析物，然後通過對衍生物的定量實現檢測母體瘦肉精的目標。圖1為CLB分子結構，圖2為CLB衍生化結構式。賈濤[5]應用GC-MS儀器測定豬飼料中的瘦肉精，添加回收率高達88.2%～98.2%，檢出限低至0.50 μg/kg。

2.4　免疫分析法

免疫分析法根據抗原或抗體標記物質之間的差異，可以分為熒光免疫分析、酶聯免疫法、膠體金免疫分析、化學發光免疫分析及放射免疫分析等。

3　展望

自“瘦肉精事件”後，國家對CLB類瘦肉精的監管力度有所增強，但市場上不斷有新型的瘦肉精出現。雖然瘦肉精的預處理和檢測技術日漸完善，但仍然存在一定缺陷，使用單一的檢測技術不能解決問題，例如HPLC、GC等儀器對瘦肉精的檢測雖然靈敏度高，並且假陽性低，使用該類儀器前處理過程比較煩瑣且儀器昂貴，對於專業人員的要求也較高，不能滿足原位快速檢測的技術需求。ELISA克服了上述儀器檢測方法的缺陷，但是該種方法檢測出來的結果假陽性高，所以應將多種檢測技術聯合使用，取長補短，不斷提高靈敏度，降低檢出限。

目前國內外檢測瘦肉精的手段技術還沒有完全完善，並未建立準確、快速、方便的預處理和檢測手段，在線檢測瘦肉精就勢在必行，瘦肉精的發展趨勢可能包括以下兩個方麵。

(1)納米材料是非常敏感的生物化學傳感器，納米生物傳感器是固定選擇性結合靶分子的生物探針的傳感器，能夠與免疫技術、生物芯片、標記技術等手段結合，快速、高效地檢測豬肉中的瘦肉精殘留。特異性納米材料可用於瘦肉精化合物的吸附、提取，並與後續的固相萃取和固相微萃取相結合，同時也可應用於熒光分析和納米酶等方麵。今後隨著納米技術的不斷深入發展，傳感器將更加的微型化，檢測時方便攜帶，自動化程度也會更高，方便在線檢測。

(2)納米金免疫標記技術是蛋白質等高分子被吸附到納米金顆粒表麵，金顆粒的特點是高電子密度，在金標蛋白結合處，可以在顯微鏡下看見黑褐色的顆粒物，當標記物在相應的配體處出現大量聚集的時候，通過肉眼觀察到紅色或粉紅色斑點，可用於定性或半定量的檢測。

相關的部門工作人員應根據不同方法的優缺點，發揮這些技術的長處，保障動物世界杯賽程預測。隨著科技的發展，可以相信未來一定會有更加方便、快速、經濟、靈敏的檢測方法，更加有效地檢測瘦肉精的含量。

參考文獻

[1]陳海玲,謝維平.豬肝樣品中萊克多巴胺測定的前處理方法[J].分析科學學報,2016,32(3):435-438.

[2]張絜青,陳煦,劉清.固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜測定豬肉中瘦肉精方法研究[J].中國衛生檢驗雜誌,2010,20(9):2182-2183.

[3]KUNPING Y,HUIQUN Z,WENLI H,et al.Rapid screening of toxic salbutamol,ractopamine,and clenbuterol in pork sample by high-performance liquid chromatography-UV method.Journal of Food and Drug Analysis,2016,24(2):277-283.

[4]金雁,姚家彪,郭雋等.豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇、OTC、TE殘留量的HPLC同時測定方法研究[J].檢驗檢疫科學,2008(5):30-33.

[5]賈濤.氣相色譜-串聯質譜法測定飼料中的瘦肉精[J].飼料與畜牧,2013,6(7):39-44.

基金項目：蘇州市科技局項目(SNG2018051)。

作者簡介：王晗瑜(1998—)，女，江蘇蘇州人，本科在讀。研究方向：環境監測。

通信作者：王學東(1967—)，男，河南淮陽人，博士，教授。研究方向：環境分析。