利用HPLC內標法測定益生菌類保健食品中低聚木糖的含量

張超然1，王墨陽2，林　林1

(1.哈爾濱美華生物技術股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150010;

2.哈爾濱市疾病預防控製中心，黑龍江哈爾濱 150001)

摘　要：低聚木糖作為益生元，常應用於益生菌類保健食品中。本文利用高效液相色譜-紫外檢測器，以鹽酸氨基葡萄糖作為內標物，進行柱前衍生化後測定低聚木糖在益生菌保健食品中的含量。將樣品溶解後，經硫酸水解，以苯基甲基吡唑啉酮()作為衍生化試劑，選擇流動相為乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，進行梯度洗脫，水解前後的木糖含量差值，即為低聚木糖的含量。該測定方法在質量濃度20～1 000 μg/mL的範圍內呈現良好的線性關係，其相關係數(2)為0.999 6，檢出限和定量限分別是1.9 mg/100 g和6.8 mg/100 g。加標回收率在88.7%～98.5%，相對標準偏差在1.1%～4.0%;在重複性試驗中，相對標準偏差為1.03%。結果表明該方法在測定益生菌類保健食品中低聚木糖含量具有良好的準確性和靈敏度。

關鍵詞：低聚木糖;PMP柱前衍生;益生菌類保健食品

低聚木糖來源廣泛，可從甘蔗渣、玉米棒、麥麩、稻殼和棉稈等植物中提取獲得[1]，含有2～10個木糖分子由β-1,4-糖苷鍵連接的低聚物[2]。低聚木糖具有多種生物活性，尤其是在益生菌保健食品中，作為益生元，為益生菌供能，具有促進腸道益生菌的生長的作用[3-4]，同時還可以加速脂肪代謝，改善鈣的吸收[5]，預防齲齒[6]，作為抗氧化劑[2]。因其具有較好的穩定性[1]，已被廣泛應用於食品、保健食品中。

現有的對低聚木糖測定的標準GB/T 35545—2017和QB/T 2984—2008，主要適用於以玉米芯為原料，經酶解精製而成的低聚木糖，兩個標準為低聚木糖原料的測定標準，其檢測設備為高效液相色譜-示差檢測器，需要的標準品為木糖，木二糖至木六糖，葡萄糖及-阿拉伯糖。該方法作為食品中添加的低聚木糖的檢測手段，檢測成本高，同時益生菌類保健食品中常含有大量的蛋白質，大量蛋白質在醇沉過程中包裹低聚木糖，使測量數據偏低，需要針對其測定方法進行進一步探究，可應用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器進行食品中低聚木糖的測定[7-8]。有研究表明衍生化技術作為糖類物質分析的新技術，通過離子化效率，從而提高檢測的靈敏度。其中，以苯基甲基吡唑啉酮()為代表的,取代的吡唑啉酮類衍生試劑和糖鏈還原性末端的反應在弱堿性介質中進行，具有條件溫和、衍生產物穩定無立體異構體紫外吸收強和適於多種類型糖鏈分析等優點，被廣泛應用於糖類檢測[9]。林欽恒等[10]利用柱前衍生的方法測定了潤腸通便類保健食品中低聚木糖的含量，錢韻旭等[11]對白花蛇舌草多糖成分分析中，利用柱前衍生-高效液相的方法確定其由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成。本文利用PMP柱前衍生-高效液相色譜法對於益生菌類保健食品中低聚木糖含量的測定進行係統地分析，並以鹽酸氨基葡萄糖作為內標物質，對於本類產品中低聚木糖的檢測具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

益生菌類保健食品產品，來自於哈爾濱美華生物技術股份有限公司。

木糖標準品(純度為99.5%)，中國藥品生物製品檢定所;D-氨基葡萄糖標準品(純度為99%)，中國藥品生物製品檢定所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，分析純)，天津市大茂化工有限公司;乙腈(色譜純)，美國FISHER公司;乙酸銨(優級純)，福晨(天津)化學試劑有限公司;甲醇(色譜純)，美國FISHER公司;試驗用水為去離子水;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯甲烷均為分析純，購自天津化學試劑公司。

1.2　儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜儀(配有紫外檢測器)，賽默飛世爾科技;HH4恒溫水浴鍋，無錫沃信儀器製造有限公司;KQ-50B型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司;FA2104電子分析天平(精度：0.000 1 g)，上海良平儀器儀表有限公司;VORTEX-KB3旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器製造有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1　色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國FISHER公司;流動相：乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，梯度洗脫;柱溫：30 ℃;波長：250 nm;流速：1.0 mL/min;進樣量：10 μL。

1.3.2　標準溶液係列的配製

(1)內標溶液製備。配製適量10 mg/mL的D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，作為內標溶液。

(2)標準溶液配製。準確稱取適量木糖標準品於100 mL容量瓶中，用去離子水溶解配製成10 mg/mL的標準儲備溶液，再將儲備溶液稀釋成20.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、400.0 μg/mL和800.0 μg/mL的係列工作溶液，並分別按比例加入內標溶液。

1.3.3　樣品前處理

(1)樣品水解前溶液製備。準確稱取樣品1.5 g(精確度為0.000 1 g)，用0.005 mol/L硫酸溶液溶解並超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，定容至50 mL。

(2)樣品水解後溶液製備。準確稱取樣品1.5 g(精確度為0.000 1g)，用0.005 mol/L硫酸溶液溶解並超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，添加0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，添加120 μL的4.0 mol/L硫酸溶液於沸水浴水解100 min，取出，冷卻，添加240 μL的4.0 mol/L NaOH溶液，用水定容至50 mL，備用。

1.3.4　衍生化反應

標準溶液與樣品水解前後溶液各吸取400 μL，加0.5 mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液與0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應120 min。再加0.3 mol/L的鹽酸溶液調節至中性，混勻，冷卻後用三氯甲烷洗滌3次，棄去三氯甲烷液，水層過0.45 μm濾膜，待上機測定[10]。

1.4　低聚木糖的計算

計算水解前後木糖含量的差值即為低聚木糖(以木糖計)的含量。

2　結果與分析

2.1　流動相的選擇

根據相關文獻，對常用於該試驗的流動相進行了總結，發現乙酸銨[2,8,11]和磷酸鈉[12]都可作為流動相，不同的pH，對各糖類物質出峰時間及分離程度有影響，所以本試驗選取0.05 mol/L乙酸銨溶液，pH為5.0，7.0，8.0，分別用乙酸和三乙胺進行pH調節;0.05 mol/L磷酸鈉，pH為8.0，用磷酸進行調節，以上作為A相。B相為乙腈，進行梯度洗脫。根據內標和外標物及產品的峰分離程度及出峰時間，選擇0.05 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.0)-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，分離效果最好。

2.2　內標物的選擇

由於前處理衍生化試驗中，需對溶液進行pH調節，且前處理相對複雜，從而試驗操作誤差影響其溶液中木糖的含量，所以根據糖類極性上的差異，選取鹽酸氨基葡萄糖作為內標物質，對其測定值進行校正。同時，鹽酸氨基葡萄糖在波長250 nm下具有較大的吸收，且不會幹擾產品中其他成分，所以鹽酸氨基葡萄糖對於該方法是比較好的內標物質。

2.3　標準曲線、檢出限和定量限

本試驗配製的標準溶液濃度為20.0 μg/mL，50.0 μg/mL，100.0 μg/mL，200.0 μg/mL，400.0 μg/mL和800.0μg/mL，以木糖標準品的質量濃度(X)為橫坐標，衍生產物的響應值(Y)為縱坐標，低聚木糖質量濃度在20~1 000 μg/mL的範圍內呈現良好的線性關係，得到的線性方程y=1.384 4x-1.098 6，相對係數(2)為0.999 6。按3倍信噪比計算檢出限為1.9 mg/100 g;以10倍信噪比計算定量限，定量限為6.8 mg/100 g。

2.4　準確度試驗

試驗選取了兩款低聚木糖含量不同的益生菌類保健食品樣品，分別測出本底值，在根據不同樣品的低聚木糖含量，添加標準品(按樣品含量的80%、100%和120%)，每個水平製備5份樣品進行測定。按照“1.2.4衍生化反應”試驗步驟進行測定，計算回收率以及相對標準偏差(值)。結果表明，平均回收率為88.7%～98.5%，相對標準偏差為1.1%～4.0%。

2.5　重複性試驗

精密吸取樣品製備液10 μL，連續6次進樣，測得的相對標準偏差為1.03%，證明該方法的精密度較高。

2.6　產品測定

選取本公司5款益生菌類保健食品(n=3)進行檢驗測定低聚木糖含量，檢測結果見表3，色譜圖見圖1和圖2。產品中含少量木糖成分，所以水解前測量值不為零，在計算時應減去。

3　結論

本文建立了測定益生菌類保健食品中低聚木糖的測定方法，采用高效液相色譜-紫外檢測器並結合PMP柱前衍生化進行測定。結果表明，由於樣品需經過水解及柱前衍生化，前處理較為複雜，選擇以鹽酸氨基葡萄糖作為內標物質，對實驗中產生的誤差進行了校正，從而提高了檢測準確性。同時對方法的線性、靈敏度、回收率、重複性及實際產品測定等多個方麵進行了考察。結果表明，該方法具有較高的靈敏性及準確性，可應用於相關益生菌類保健食品的低聚木糖含量的測定。

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作者簡介：張超然(1989—)，女，遼寧黑山人，碩士，工程師。研究方向：食品質量與安全。