高效液相色譜儀、酶標儀和快檢儀檢測小麥中嘔吐毒素的對比分析

陳 舟

(襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北襄陽 441000)

摘 要：為高效完成小麥中嘔吐毒素的精準檢測，本文通過多維度實驗對高效液相色譜儀、酶標儀和真菌毒素快速檢測儀檢測小麥中嘔吐毒素處理過程和檢測數據進行對比分析，3種設備檢驗操作過程中各有優劣，檢測結果能滿足不同需求。快檢儀適合快速定性篩查，酶標儀可用於高通量檢測，高效液相色譜儀可進行精準檢測和定量複核。綜合分析得出，在實際應用中，3種設備可以配合使用，相互補充，靈活運用各種設備優勢，可高效完成各種檢測需求。

關鍵詞：高效液相色譜儀;酶標儀;快檢儀;嘔吐毒素;小麥

嘔吐毒素，又名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，主要由禾穀鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生，是一種全球性的汙染穀物的黴菌毒素之一，通常在小麥、大麥、燕麥、玉米等穀物及其製品中最為常見。DON超標攝入會導致人畜厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩和反應遲鈍等急性中毒症狀，嚴重時會導致組織壞死和內髒出血，甚至死亡[1]。正因為DON對人類的生命健康有很大的威脅，我國對小麥中的DON含量製定了嚴格的限量標準。

當前，我國檢測機構針對小麥中的DON檢測設備有很多種，但涉及檢測原理主要有串聯質譜法、高效液相色譜法、薄層色譜測定法、酶聯免疫吸附篩查法、膠體金紙層析免疫法等。在DON檢測中根據不同的需求，選擇不同的設備和方法來檢測，對於檢測效率至關重要，因此，本文通過實驗對高效液相色譜儀、酶標儀、真菌毒素快速檢測儀3種設備檢測小麥中DON的優劣進行對比分析。

1 材料與方法

1.1　儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器，島津;Model-680酶標儀，美國伯樂;ROSA-M快檢儀，美國CHARM;TLE204E/02電子天平，梅特勒-托利多;PHC-11D氮吹儀，月旭科技(上海);HY-4振蕩器，金壇市大地自動化儀器;800D離心機，常州普天儀器;DON免疫親和柱，安譜(CNW);Deoxynivalenol標準品，安譜(ANPEL);DON檢測試劑盒，芬德生物(SZ FINDE);ROSA DON快檢試劑條，美國CHARM。

DON質控樣-1、DON質控樣-2，國家糧食和物資儲備局科學研究院;甲醇(色譜純);聚乙二醇(生化試劑);氯化鈉(分析純);磷酸氫二鈉(分析純);磷酸二氫鉀(分析純);氯化鉀(分析純);鹽酸(優級純);去離子水。

1.2　樣品前處理

1.2.1　高效液相色譜儀

稱取25 g樣品於100 mL具塞三角瓶，加5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，振蕩20 min。以玻璃纖維濾紙過濾至澄清，移取濾液2.0 mL，以1滴/s流速過免疫親和柱，再分別用5 mL PBS緩衝鹽溶液和水先後淋洗，棄去流出液，抽幹小柱。加2 mL甲醇洗脫親和柱，下滴速度1滴/s，收集洗脫液，50 ℃下氮氣緩緩吹至近幹，最後加入1.0 mL初始流動相，渦旋30 s溶解，0.45 μm濾膜過濾，取濾液入進樣小瓶待上機檢測。

1.2.2　酶標儀

稱取5.0 g粉碎樣品於50 mL離心管，加入20 mL去離子水，振蕩5 min，室溫4 000 r/min離心10 min;靜置分層，取0.1 mL上清液，加入0.9 mL複溶液，混勻，待測。

1.2.3 DON快速檢測儀

準確稱量5.0 g粉碎樣品於50 mL的離心管，加入25 mL的去離子水，渦旋振蕩1 min，靜置1 min，取1 000 μL上清液於1號離心管中，放入離心機5 000 r/ min，離心1 min後，從中取100 μL樣品提取液和1 000 μL嘔吐毒素稀釋緩衝液(DONQ)放入2號離心管，渦旋振蕩10 s，待測。

1.3 上機檢測

1.3.1 高效液相色譜儀

高效液相色譜儀設置紫外檢測器，色譜柱：XB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，其餘色譜條件參考GB 5009.111—2016[2]。

1.3.2　酶標儀

加標準品和樣品50 μL/孔到對應微孔中，然後加抗體工作液50 μL/孔，輕輕震蕩5 s混勻，37 ℃避光反應30 min。

洗板：甩幹孔中液體，用工作洗滌液350 μL/孔充分洗滌5次，每次間隔30 s，最後用吸水紙拍幹。加酶標記物

100 μL/孔，37 ℃避光反應30 min。再次洗板(同上)。顯色：加底物A 50 μL/孔，再加底物B 50 μL/孔，輕輕振蕩5 min混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。酶標儀於450 nm(建議雙波長450/630 nm)處上機測定每孔值。

1.3.3　DON快速檢測儀

讀數儀調至DON-00檔。取嘔吐毒素快檢試劑條(綠色)，將其反麵放入孵育器中，膠紙撕開至黑線處，取300 μL待測稀釋液，緩慢加入試劑條凹槽中後蓋上膠紙，45 ℃下孵育5 min後，插入讀數儀測定讀數。

1.4　儀器檢測原理對比

(1)高效液相色譜儀(紫外檢測器)。利用物質在色譜柱流動相與固定相之間有不同的分配量，進行DON分離，不同濃度的DON在紫外檢測器引起不同響應值進而輸出不同峰形，最後用外標法定量。

(2)酶標儀篩查原理。基於抗原抗體間接競爭反應技術，DON和酶標板上的預包被偶聯抗原競爭抗嘔吐毒素抗體，標記後用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含DON量成負相關，與標準曲線比較後得出具體值。

(3)DON快檢測試儀檢測原理。基於膠體金免疫層析技術，以膠體金作為示蹤標誌物，根據膠體金本身的顯色特點來診斷特異性的待測物。

2　結果與分析

2.1　回收率與精密度、質控樣精準度試驗

在空白小麥樣品中分別加入3組不同濃度的DON標準溶液，按照正常試驗步驟進行前處理和檢測，每個加標樣品重複測定6次，測定其回收率和精密度，結果見表1。由表1可知，3種設備檢測方法的回收率和精密度均達標[3]。在低濃度檢測時高效液相色譜儀回收率略顯偏低，可能由於其方法前處理相對複雜，造成一定的DON損失。精密度方麵，高效液相色譜儀精密度最高，穩定性最好。

將兩個不同濃度DON質控樣，按照正常試驗步驟進行前處理和檢測，每個濃度做4個平行樣，測定其準確度，結果見表2。從表2中可知高效液相色譜儀準確度最高，其次是酶標儀，快檢儀準確度略顯不足，尤其是高濃度檢測時更明顯。由於快檢儀檢測原理和膠體金紙試劑條製備工藝等原因，快檢儀不適合做定量檢測。另外經過多次試驗得出，酶標儀在高通量樣品檢測時，由於抗體的交叉反應、稀釋倍數及操作汙染等因素影響，有出假陽性風險，故陽性試樣需進一步驗證[4]。

2.2　3種設備的操作使用對比

對3種設備在單位樣品檢驗時間、費用、操作等方麵進行綜合比較，結果見表3。從表3中可知，3種檢測設備各有優劣，檢測機構、企業或者檢驗人員可根據自身不同需求和環境、樣品量等因素綜合考量來選擇最合適的設備進行檢驗。尤其是快檢儀操作簡便、靈敏度高，適合於樣品的快速篩查，可滿足我國糧食及飼料企業、政府職能監管部門等開展日常現場檢驗和監管抽查工作[5]。

3　結論

本文主要對高效液相色譜儀、酶標儀、真菌毒素快速檢測儀檢測小麥中嘔吐毒素的操作過程和檢測結果進行對比分析。

從操作過程看，高效液相色譜儀前處理最為複雜和關鍵，直接影響結果準確度，另外消耗試劑較多，易造成汙染，主要操作為電腦軟件，能自動連續處理樣品，可用於科研和高質量檢驗，對人員能力有一定要求;酶標儀操作過程相對簡單，所需耗材成本也較低，但因其配置試劑較多，操作暴露風險較大，有一定安全隱患，但能同時上機檢測96個樣品，單批次平均成本低，也可用於現場實驗，人員操作易上手;快檢儀操作最為簡單，所用耗材也較少，檢測過程比較安全，檢測速度較快，人員水平要求較低。

從檢測結果來看，3種設備回收率和精密度均符合要求，其中高效液相色譜儀精密度和準確度最高;酶標儀檢測可能會出現假陽性，因此在其檢測出陽性樣品時，可用高效液相色譜儀進行複檢確認;快速檢測儀檢測速度較快，但其定量檢測準確度不高，比較適用於快速定性檢測。

在實際應用中，3種設備可以相互配合使用，靈活運用各種設備優勢來高效率完成工作。糧食企業單位在新糧收購、轉運時可運用快速檢測儀進行糧食DON指標快速篩查，檢測機構在集中進行糧食品質分析時，可運用酶標儀進行高通量檢測[6]，對以上兩個設備篩檢出的陽性批次可用高效液相色譜儀進行精準複核，提升檢測效率。日常檢驗工作中，快檢儀和酶標儀可為高效液相色譜儀提供輔助性檢測，相互補充，取長補短，為精準高效檢驗嘔吐毒素共同提供數據參考。

參考文獻

[1]張春娥,劉新保,廖若宇,等.高效液相色譜法測定全麥粉中的嘔吐毒素含量[J].糧油食品科技,2018,26(5):53-57.

[2]國家衛生和計劃生育委員會,國家食品藥品監督管理總局.世界杯賽程預測國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定:GB 5009.111—2016[S].北京:中國標準出版社,2016.

[3]國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.實驗室質量控製規範 食品理化檢測:GB/T 27404—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.

[4]賈衛昌,朱寅.高效液相色譜法與酶聯免疫法檢測小麥中嘔吐毒素的比較研究[J].糧食與食品工業，2015,22(3):97-100.

[5]李萌,馮才偉,賈芳芳,等.一種快速檢測嘔吐毒素的膠體金試紙條[J].中國釀造,2013,32(11):91-93.

[6]莊芸蕾.膠體金免疫快速檢測卡與酶聯免疫法檢測小麥中嘔吐毒素的技術比較[J].糧食儲藏,2017,46(3):38-41.