高效液相色譜柱後衍生法測定大黃䗪蟲丸中的黃曲黴毒素

賀敏才，盧向紅，袁邦群
(婁底市食品藥品檢驗檢測所，湖南婁底 417000)
摘 要：目的：建立高效液相色譜法測定大黃䗪蟲丸中黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2的含量，並評價大黃䗪蟲丸中黃曲黴毒素的安全性。方法：采用高效液相色譜柱後光化學衍生法，色譜柱為Intersil ODS-3 C18柱，流動相為甲醇-水，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，熒光檢測器，激發波長360 nm，發射波長450 nm。結果：黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2分別在10.2～51.0 pg（r=0.998 9）、4.3～21.5 pg（r=0.999 6）、10.6～53.0 pg（r=0.998 6）、3.8～19.0 pg（r=0.999 6）範圍內，具有良好的線性關係，其加樣回收率在83%～94%，RSD為1.56%～2.11%。有9批樣品檢出黃曲黴毒素，其總含量在0.2657～1.5805 μg/kg。結論：本方法專屬性強，操作簡單，結果穩定可靠，分離度好，可用於大黃䗪蟲丸中黃曲黴毒素的質量控製。
關鍵詞：大黃䗪蟲丸；黃曲黴毒素；柱後光化學衍生法；高效液相色譜法

黃曲黴毒素是由黃曲黴和寄生曲黴中產毒菌株產生的一類致癌物質，可誘發肝、腎、肺、胃、結腸等部位的癌變，是目前為止發現的毒性最大的真菌毒素。黃曲黴毒素可以通過多種途徑汙染食品和飼料，直接或間接地進入食物鏈，從而威脅人們的健康和生命安全。目前有100多個國家已經製訂了食品中黃曲黴的法規標準及檢測方法，我國也已於2011年4月20日發布了《 世界杯賽程預測國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2011），其規定了食品中黃曲黴毒素的限量指標。《中國藥典》2005年版增補本收載了黃曲黴毒素的測定方法，並規定了部分品種的限量值[1]。
大黃䗪蟲丸是由熟大黃、土鱉蟲、水蛭、虻蟲、桃仁、炒苦杏仁、黃芩、地黃、白芍、甘草等十二味藥經粉碎、過篩和混勻製成的複方製劑。其功效是活血破瘀，通經消癥。常用於瘀血內停所致的癥瘕、閉經，症見腹部腫塊、肌膚甲錯、麵色黯黑、潮熱羸瘦、經閉不行[2]。《中國藥典》2020年版一部對其中的土鱉蟲、水蛭、桃仁的黃曲黴毒素進行了限量控製[2]。目前對大黃䗪蟲丸安全性方麵的研究尚未見報道，為進一步保證藥品的安全性，本試驗參照《中國藥典》2020年版四部通則2351及有關文獻資料[3-9],采用高效液相色譜法柱後衍生法，對大黃䗪蟲丸中黃曲黴毒素進行檢測，以了解大黃䗪蟲丸中黃曲黴毒素汙染狀況，並為臨床安全用藥提供數據資料。
1 儀器與方法
1.1 儀器
Waters e2695高效液相譜儀（帶自動進樣器、柱溫箱、熒光檢測器、工作站）；梅特勒-托利多電子分析天平（千分之一）；光化學衍生器Huirentek PHRED-HR；高速勻質機D-500（Madeby Wiggens）；離心機TG16G（湖南凱達科學儀器有限公司）。
1.2 試劑
免疫親和柱（ROMER，AflaStarTM R，Lot：1000004945）；黃曲黴毒素混合標準品溶液（中國食品藥品檢定研究院610001-201602）； 甲 醇、 乙 腈 均 為 色 譜 純； Ⅰ 級 純 化水（自製）；其他試劑均為分析純。大黃䗪蟲丸（批號為20170908、20171112、20171217、20180503、20180810、20181109、20190505、20191202、20191211、20200610，由某製藥公司生產）。
1.3 試驗方法
1.3.1 色譜條件
色譜柱：Intersil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相為甲醇-水，梯度洗脫（比例見表1），流速為1.0 mL/min；柱後衍生-光化學衍生法；熒光檢測器，激發波長360 nm，發射波長450 nm，進樣量20 μL。


1.3.2 溶液製備
（1）混合對照品溶液製備。取黃曲黴毒素混合標準品溶液（黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2標示濃度分別為1.02 μg/mL、0.43 μg/mL、1.06 μg/mL、0.38 μg/mL）1.00 mL，加甲醇稀釋至50.00 mL，作為儲備液，量取儲備液1.00 mL，加甲醇稀釋至10.00 mL。
（2）供試品溶液製備。取供試品粉末15 g，置均質瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min（攪拌速度大於11 000 r/min），離心5 min（離心速度4 000 r/min），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，離心5 min（離心速度4 000 r/min），取上清液20.00 mL，通過免疫親和柱，流速3 mL/min，用20 mL水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再加2.00 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用甲醇稀釋至2.00 mL，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取濾液備用。
（3）陰性樣品溶液製備。取檢測無黃曲黴毒素的藥材，按照藥典製法製成大黃䗪蟲丸樣品，取樣品15 g，同供試品方法製備，即得。
2　結果與分析
2.1 係統適應性試驗
按照1.3.1的色譜條件，分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖（見圖1）。由圖1可知，黃曲黴毒素各組分完全分離（分離度大於1.5），陰性樣品無幹擾。

2.2 方法學考察
2.2.1 線性相關性考察
按照1.3.1的色譜條件，精密吸取1.3.2（1）的黃曲黴毒素混合對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL進行測定，記錄色譜圖，以對照品量為橫坐標（X,pg），峰麵積為縱坐標（Y），繪製標準曲線，結果見表2

2.2.2 精密度試驗
按照1.3.1的色譜條件，吸取混合對照品溶液15 μL，進樣6次，測定峰麵積，結果表明，黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2的RSD分別為2.43%，1.86%，2.99%，2.05%，表明儀器的精密度良好。
2.2.3 穩定性試驗
取供試品溶液（批號20191202）1.0mL，加入混合對照品溶液0.10 mL，分別製備2 h、4 h、6 h、12 h、16 h和24 h後，按照1.3.1的色譜條件進行測定，結果表明，黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2的RSD分別為2.03%，1.98%，2.69%，2.32%，表明供試品溶液在24 h內測定穩定。
2.2.4 重複性試驗
取樣品（批號20180810），按1.3.2（2）的方法，製備6份供試品溶液，按照1.3.1的色譜條件進行測定。結果表明，黃曲黴素B1的RSD為3.02%，黃曲黴毒素總量的RSD為4.12%，表明該方法重複性良好。
2.2.5 加樣回收率試驗
精密稱取未檢出黃曲黴毒素的樣品約7.5 g（批號20181109），6份，分別加入1.3.2（1）的黃曲黴毒素混合對照品溶液儲備液0.10 mL，按照1.3.2（2）的方法製備，按照1.3.1的色譜條件進行測定，計算黃曲黴毒素的RSD和回收率。結果表明，黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分別為94%，86%，89%，83%；RSD分別為1.89%,1.56%，2.11%，2.03%（n=6）。
2.2.6 檢測限和定量限試驗
倍比稀釋混合對照品溶液，在信噪比約為3時，測得黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2的檢測限分別為0.408 pg，0.172 pg，0.424 pg，0.152 pg；在信噪比約為10時，測得黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2的定量限分別為1.346 pg，0.585 pg，1.421 pg，0.519 pg。
2.2.7 樣品含量測定
取10批次樣品，按照1.3.2（2）的方法製備供試品溶液，按照1.3.1的色譜條件進行測定，結果見表3。

3 結論
①本試驗中，曾按《中國藥典》一部方法選用甲醇-乙腈-水（40∶1842）作為流動相，分離效果不理性，樣品中其他成分幹擾大，最後選用甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，各黃曲黴毒素峰分離效果好，其他成分無幹擾。②對10批次樣品進行檢測，其中有9批中有黃曲黴毒素的檢出，結果黃曲黴毒素B1的含量均少於1 μg/kg，黃曲黴毒素的總量均小於2 μg/kg，都低於藥典規定的限度值（5 μg/kg，10 μg/kg）。表明大黃䗪蟲丸安全性較好，但檢出率高到90%，仍應重視黃曲黴毒素的檢測。③本方法具有專屬性強，操作簡單，結果穩定可靠，分離度好等特點，可作為用於大黃䗪蟲丸中黃曲黴毒素的含量測定的方法。④大黃䗪蟲丸中的熟大黃、桃仁、炒苦杏仁、甘草等及主要輔料蜂蜜，有的屬於藥食同源，有的可用於保健食品。而本次試驗中黃曲黴毒素的檢出率極高，相關部門應反思其原料的安全性，尤其上述廣泛作為食品使用的藥材，進而保證廣大消費者的飲食用藥安全。
參考文獻
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[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2020.
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作者簡介：賀敏才（1983—），女，湖南雙峰人，本科，主管中藥師。研究方向：食品藥品檢驗工作與質量標準。