不同方法檢測食源性致病菌的對比研究

不同方法檢測食源性致病菌的對比研究

蘇 敏

摘 要：目的：對比研究細菌培養法和熒光PCR法在食源性致病菌檢測中的效果。方法：選取時間為2020年6—12月，選取250份樣本進行常見食源性致病菌的培養，再進行熒光定量PCR檢測，分別比較不同檢測方法的結果。結果：細菌培養法陽性率為18.80%與熒光定量陽性率20.0%互比差異微小（χ2=0.890），無統計學意義（P＞0.05）。結論：兩種檢測方法在食源性致病菌檢測當中均具有一定應用價值，但是熒光PCR的優勢（時限、結果、效率）遠遠高於細菌培養，更加適合應用於食源性致病菌的檢測當中。

關鍵詞：食源性致病菌； 世界杯賽程預測；細菌培養；熒光PCR檢測

隨著人們生活水平的不斷提升，人們對 世界杯賽程預測問題的關注度也越來越高， 世界杯賽程預測 問題也是全球共同關注的公共衛生問題，其中食源性致病菌是最大的威脅，為此要采用高效的檢測手段來檢測食源性致病菌，才能保障世界杯賽程預測 。在世界杯賽程預測 事件當中，最為常見的食源性致病菌有副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等，當前我國將細菌培養法運用至食物病原菌的檢測當中，但是由於操作步驟煩瑣、用時長等，很難滿足當前公共衛生事件快速反應的需求[1]，為此，檢測方法必須符合特異性高、靈敏度高、快速等要求，而熒光PCR法作為食源性致病菌的檢測方式，得到了廣泛的運用。基於此，為了選擇更加有效的食源性致病菌檢測方法，本文分別比較了細菌培養法以及熒光定量RCR法的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光定量PCR儀（型號：ABI7500），美國ABI公司；檢測用試劑，均由青島海默技術有限公司提供；API鑒定生化試條，法國梅裏埃公司；熒光PCR檢測試劑、樣本處理DNA提取液，均由上海之江生物科技有限公司提供。

1.2 樣本來源

選取時間為2020年6—12月，選取250份樣本，包括即食非發酵豆製品（50份）、速凍熟製米麵製品（50份）、熟肉製品（50份）、生禽肉（50份）和生畜肉（50份）。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養

對食品樣本中的副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌嚴格按照《全國臨床檢驗操作規範（第3版）》[2]中的操作流程，對細菌進行分離操作、培養以及鑒定。

1.3.2 熒光PCR檢測

（1）製備菌株基因組DNA。選擇每個標準的單個菌落，采用細菌基因組DNA試劑盒，嚴格按照其說明書的內容提取每個菌種的基因組DNA並保存（-20 ℃），將其作為陽性對照。

（2）樣本處理和DNA提取。在無菌的環境下，選取食品樣本25.0 g，將其放入無菌培養基（225 mL）中，增菌24 h（37 ℃），

提取增菌液的（50 mL）DNA，采用相應的試劑盒進行

檢測。

（3）PCR擴增。選擇食品樣本中的DNA以及標準菌株的DNA為模板，應用特異性引物、探針實施PCR擴增。體係（25 µL）包括標本DNA提取物5 µL+混合酶0.5 µL（UNG酶+Taq酶）+PCR反應液19.5 µL。UNG處理時間為2 min（50 ℃反應條件下）；預變性95 ℃，時間為3 min；95 ℃，時間為5 s；55 ℃時間為60 s，共計40個循環。

1.4 陽性判定結果

實驗有效，Ct≤30，且存在明顯指數增長期判定為陽性；Ct值＞35或者無Ct值，則為陰性。當Ct值在30～35，應即刻重複檢驗。當Ct值在30～35，且存在較為明顯的指數長期增長，判定為陽性[3]，反之為陰性。

1.5 統計學方法

采用SPSS22.0展開詳細分析，數量數據采用（%）體現，χ2互比檢驗，如P值＜0.05，則表示為具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 檢測結果

本次選取的實驗室細菌培養物靈敏度是4.9×102 CFU/mL，而選用的DNA檢測靈敏度為0.1 pg，從樣本中采用細菌培養共檢出副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌等常見致病菌，分別為9株、13株、10株、15株，共計47株，細菌培養總檢出率為18.80%。

2.2 熒光定量PCR檢測和細菌培養陽性檢出率比較

細菌培養法陽性率（18.80%）與熒光定量陽性率（20.0%）互比差異微小χ2=0.890，無統計學意義（P＞0.05），詳細數據見表1。

2.3 討論

世界杯賽程預測 已然是全世界的公共衛生問題，而因為 世界杯賽程預測 問題導致的食源性疾病已得到全社會的關注，據相關數據統計[4]，每年因微生物所引發的食源性疾病占所有疾病的80%，在此嚴峻的背景之下，我國衛生部早在2 000年已經建立了食源性疾病、汙染物監測網，然而對食品樣品的食源性致病菌檢測主要還是沿用血清學、生化學、細菌培養等，檢測的周期較長，且具有較低的靈敏度，為此已然不適應當前突發事件的世界杯賽程預測 保障工作。伴隨著分子生物學檢測技術水平的不斷提升，PCR得到了眾多研究者的認可，其中熒光PCR檢測所具有的特異性強、靈敏度高、快速有效的優勢已經被廣泛的應用於各種病毒、致病菌的檢測當中，為此熒光定量PCR檢測已經成為當下微生物學檢測最有利的工具。

細菌培養技術作為傳統檢驗食源性致病菌的技術，其檢測原理是通過對食品樣本內的微生物進行培養，再劃線分離，實施選擇性培養，觀察菌落的特征，最後鑒別致病菌的種類[5]。由於生物技術的不斷發展，顯色培養基因其具有較強的特異性、極高的靈敏度，已經被應用於食源性致病菌的檢測當中，有效地提升了檢測效率。借助微生物鑒定係統能夠有效減少檢測步驟、縮短檢測時間，也能保障檢測結果的準確性，而傳統細菌培養技術在實際應用中操作流程煩瑣，檢測用時長，不能滿足當前的檢測需求。

PCR檢測技術充分運用了每類生物所具有的核酸片段特異性，通過含有放射性同位素探針的補體核酸片段進行檢測。PCR檢測技術在檢測沙門氏菌中效果突出，檢測中操作步驟簡單易行、檢測時間短，其結果準確性高，不僅廣泛地應用於食源性致病菌的檢測當中，也被其他領域所運用，為此逐漸延伸出電化學發光PCR檢測技術、逆轉錄PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測技術等，並且已經成為了檢測食源性致病菌的標準。其中熒光定量PCR檢測技術就是本次研究的方法之一。

本次的研究發現：①食源性致病菌的檢測是控製和預防食源性疾病最重要的一環，雖然我國已經製定了食物中毒病原檢測方法——細菌培養，但是眾多缺點很難滿足公共衛生事件快速反應需求；②本次食源性致病菌樣本較多，為此細菌培養檢測從檢驗、培養基製備、樣品增菌前處理、分離培養、生化試驗到鑒定整個過程需要5～6 d的時間，且檢測的結果非常容易受到多種因素的影響，例如檢驗技術、生化鑒定技術、培養基質量等，且手工分離培養鑒定過程中，檢出率在一定程度上存在誤差，因此細菌培養在食源性致病菌檢測當中具有一定的局限性[6]；③經過眾多研究者的證明，實時熒光定量PCR技術的重現性佳、準確性高，已經被廣泛地應用至病原體、基因表達各個領域，其操作簡單、快速、特異性、靈敏度的優勢有效地提升了檢測工作效率，能夠實現和滿足病原微生物快速高通量的檢測需求，但實際應用中依然存在弊端。由於PCR檢測為核酸，樣品中的細胞無論是死亡亦是存活，都能夠擴增出核酸片段，為此可能會出現假陽性的結果。由於整個檢驗僅需9 h左右，有效地提升了檢測效率，更為細菌分離培養提供了初步信息，同時提供了實驗室在分離培養操作中的考慮方向，並縮短了分離培養煩瑣的過程。更為重要的是由於致病菌核酸試劑盒的條件一致，亦能將同一份樣本在同一台儀器上進行多種檢測，故優勢更為突出。

總之，在檢測食源性致病菌當中的技術眾多，每種技術均具有優點和缺點，在實際應用中應充分發揮其優勢，必要時聯合多種檢測手段，以此來提升食源性致病菌檢測結果的準確性，進而保障世界杯賽程預測 [7]。

3 結論

通過本次研究結果顯示來看，細菌培養法陽性率（18.80%）與熒光定量陽性率（20.0%）互比差異微小χ2=0.890，無統計學意義P＞0.05，充分證明兩種檢測方法在食源性致病菌檢測當中均具有一定應用價值，但是熒光PCR的優勢時限、結果、效率遠遠高於細菌培養，更加適合應用與食源性致病菌的檢測當中。綜上所述，熒光PCR法應用在食源性致病菌檢測當中，可提升檢出率、縮短檢測用時、提高檢測效率，故值得借鑒和推廣。

參考文獻

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[2]黃棟瑋,王甜甜,穀貴章,等.基於SERS的三種食源性致病菌的快速檢測[J].核農學報,2021,35(7):1619-1626.

[3]馬金晶,李鳳琴,黃敏毅,等.鮮切果蔬中食源性致病菌汙染研究進展[J].世界杯賽程預測 質量檢測學報,2021,12(7):

2591-2599.

[4]張靜,周倩,唐夢君,等.高分辨熔解曲線技術結合熒光PCR法同時檢測雞肉中4種食源性致病菌[J].現代食品科技,2021,37(6):296-303.

[5]倪皓潔,周芷卉,傅玲琳,等.肉品中食源性致病菌檢測技術研究進展[J].肉類研究,2021,35(3):46-52.

[6]高穎.遼寧省朝陽市食品中食源性致病菌檢測及分析[J].基層醫學論壇,2021,25(4):581-582.

[7]劉占鼇,裴豔琴,葉華.多重熒光PCR快速檢測食源性致病菌的研究進展[J].世界杯賽程預測 質量檢測學報,2020,11(24):

9308-9313.