生薑蛋白酶基因的克隆及在原核細胞中的表達

生薑蛋白酶基因的克隆及在原核細胞中的表達

盧 瑛

（萊蕪職業技術學院，山東萊蕪 271100）

摘 要：提取萊蕪生薑總RNA，采用RT-PCR技術擴增出生薑蛋白酶（Ginger protease）基因GP2和GP3，經序列比對，發現萊蕪生薑蛋白酶基因GP2在945位的堿基與Gene bank中生薑蛋白酶的序列GP2b（GI:57118006）有差異，GP3在451、700和804這3個位置的堿基與GP3b（GI:57118011）有差異，在翻譯後的氨基酸也不同，表明了不同生薑品種生薑蛋白酶基因的多樣性。將克隆的GP2片段GPII重組到帶有His-tag的原核表達載體pET30a（+）中，構建重組表達載體pET-GPII。將重組pET-GPII轉化到大腸杆菌BL21（DE3）中構建工程菌株，工程菌株用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達，在誘導6 h，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，重組GPII表達量最高。SDS-PAGE凝膠電泳分析結果表明蛋白大小約為21 kDa。該實驗結果表明生薑蛋白酶能夠在原核表達係統進行大量表達，為生薑蛋白酶工程化生產奠定了基礎。

關鍵詞：萊蕪生薑；生薑蛋白酶；克隆；原核細胞；表達

生薑蛋白酶（Ginger protease/Zingibain,EC 3.4.22.67）是存在於生薑塊狀根莖中的一種巰基蛋白酶，有兩種GP-I和GP-II（GPI和GPII分別與GenBank中GP3和GP2同源性較高），均含有221個氨基酸，含有6個Cys形成3個二硫鍵為糖蛋白，具有蛋白水解活性。生薑蛋白酶能夠水解膠原蛋白，可用於肉類嫩化、酒類澄清，乳製品凝固等［1］，以薑汁為添加劑開發的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在廣東地區頗受歡迎，因此該酶具有良好的工業化應用前景［2］。

生薑蛋白酶的分離純化工藝操作複雜，而且生薑蛋白酶的含量在不同生薑品種、不同栽培地區及不同氣候條件下差異非常大，甚至同一品種的幹薑與生薑之間的含量也不相同，導致生薑蛋白酶的提取率不穩定［3］。尤其生薑常年連作導致莖腐病、斑點病和薑瘟病高發，推升了市場上生薑的價格，使得提取生薑蛋白酶的成本升高，進一步限製了生薑蛋白酶的開發利用。

本實驗從萊蕪生薑中提取總RNA，通過RT-PCR技術擴增生薑蛋白酶基因，並構建了pET-GPII原核表達載體，重組質粒在大腸杆菌BL21中實現了原核表達，為生薑蛋白酶工程化生產進行了探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種、質粒和植物材料

大腸杆菌DHB4和宿主菌BL21以及質粒pET30a（+）為本實驗室保存，萊蕪生薑購於萊蕪大潤發超市。

1.1.2 酶、試劑盒和生化試劑

dNTP、DL2000、EasyTaq DNA聚合酶、TransStart FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；植物總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀有限公司；T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；限製性內切酶KpnI、XbaI、EcoRI和反轉錄試劑盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit購自ThermoFisher公司；DNA凝膠回收試劑盒和DNA質粒提取試劑盒購自OMGEA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生薑蛋白酶cDNA的合成

根據植物總RNA提取試劑盒操作說明分離提取生薑總RNA，將RNA利用反轉錄試劑盒合成cDNA並稀釋至

50 ng/µL。

1.2.2 引物的設計與合成

根據Gen Bank（NCBI）數據庫中生薑半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI:57118005）和GP3a（GI:57118009）的上下遊序列設計特異性引物，以生薑mRNA反轉錄產物（cDNA）為模板，PCR克隆生薑蛋白酶基因。兩對特異性引物，分別為GP2a上遊引物：5’-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTAGACAAT-3’，下遊引物：5’-ATTAAAGCTTTGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’；GP3a上遊引物：5’-ATTTGGATCCATGGCTTCCTTCGTCGC-3’，下遊引物：5’-ATTAGTCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3’；GPII上遊引物：5’-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3’，下遊引物：5’-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’。

1.2.3 生薑蛋白酶原核表達載體的構建

以稀釋後的cDNA為模板，PCR擴增生薑蛋白酶基因。PCR反應程序按照TransStart FastPfu DNA聚合酶說明書執行。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離並回收目的片段。將回收的PCR產物交由上海桑尼生物科技有限公司進行測序，並與Gene Bank上已發布的序列進行比對。以GP2序列為模板克隆GPII片段，並連接到表達載體pET30a（+）載體上轉化感受態DHB4，經Kan+抗性的LB固體培養基篩選。挑取抗性重組子測序，將序列正確的克隆命名為pET-GPII。提取重組質粒轉化BL21感受態細胞。

1.2.4 生薑蛋白酶表達條件優化

將攜帶重組表達載體pET-GPII的工程菌BL21在LB培養基上培養至OD600為0.4時，分別加入0～0.5 mmol/L不同濃度的IPTG，37 ℃誘導4 h，並通過SDS電泳分析IPTG濃度對誘導結果的差異。進一步在加入0.1 mmol/L的IPTG條件下誘導0～10 h不等的時間，分析不同誘導時間對誘導結果的差異。

2 結果與分析

2.1 生薑蛋白酶基因的克隆與原核表達載體構建

通過RT-PCR成功獲得與目的基因大小相符的DNA片段。將該片段連接到原核表達載體pET-30a（+）並進行測序，GP2序列全長為1 146 bp，GP3為1 401 bp。序列比對發現與GP2與GP2b（GI:57118006）同源性為99.91%，僅在945位堿基發生改變，與GP2a（GI:57118005）相同位置的堿基一致。GP3與GP3b（GI:57118011）同源性為94.77%，有451、700和804這3個位置的堿基發生改變，與GP3a（GI:57118009）相同位置上的堿基一樣（如圖1所示），說明了不同品種生薑蛋白酶基因的多樣性。進一步以GP2為模板，克隆出了726 bp的GPII片段［4］，並將其連接到原核表達載體pET-30a（+）構建重組表達載

體pET-GPII。

注：A中1-GPII，2-GP2，3-GP3；B為生薑蛋白酶序列比對結果。

圖1 生薑蛋白酶基因序列

2.2 生薑蛋白酶的誘導表達及誘導條件優化

將重組表達載體pET-GPII轉化宿主菌BL21，培養單克隆菌落至OD600=0.4，然後添加IPTG，濃度為0.05 mmol/L，發酵1 h，4 h，6 h和10 h，以未添加IPTG的pET-GPII的菌和轉化空載體的菌為對照組，結果發現當誘導時間達到

6 h以後，目的基因的蛋白表達量沒有顯著變化（圖2A）。當加入不同濃度的IPTG時，發現0.1 mmol/L的IPTG誘導表達的蛋白量最多（圖2B）；因此推斷最佳誘導條件為37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG誘導6 h。

注：A-不同誘導時間對生薑蛋白酶表達的影響；B-不同濃度的IPTG對生薑蛋白酶表達的影響。

圖2 SDS-PAGE檢測生薑蛋白酶的表達

3 結論與討論

近年來隨著對生薑蛋白酶的深入研究，發現生薑蛋白酶對肉類具有良好的嫩化作用，對於酒類的澄清效率遠高於木瓜蛋白酶，還可作為凝乳劑來製作風味乳品。用生薑蛋白酶製備的奶酪，口感好，無苦澀感［5-6］，說明生薑蛋白酶具有潛在的商業應用價值。

原核表達係統具有遺傳背景清晰，細胞生長周期短，增殖速度快，發酵產量高，易於工程化等優點而受到歡迎，而且優化發酵條件可以使目的蛋白以可溶的形式生產。本研究成功克隆了生薑蛋白酶基因，並在原核表達係統中成功誘導表達，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導條件下表達6 h產量最高。這為生薑蛋白酶工程化生產提供了理論基礎。

參考文獻

[1]馮敏,唐春紅.生薑蛋白酶的研究概述[J].中國食品添加劑,2008(6):58-60.

[2]李田葉,李旻,安建樂,等.響應麵法優化生薑蛋白酶提取及酸奶中的應用[J].食品工業,2015,36(7):91-95.

[3]代景泉,黃雪鬆.生薑蛋白酶的分離純化[J].食品科學,2003(2):73-79.

[4]MISOOK Kim,Hamilton S E.,Guddat L W.,et al.Plant collagenase:Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger[J].2007,1770(12):1627-1635.

[5]黃冬香,李小華,李林,等.生薑蛋白酶的研究進展及其在 食品加工中的應用[J].食品工業科技,2009,30(12):406-409.

[6]範金波,侯宇,黃訓文,等.生薑蛋白酶的分離、純化及酶學性質研究[J].食品與發酵工業,2014,40(5):65-69.