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UPLC-MS/MS法測定畜肉中萊克多巴胺

2021-08-30 13:57:17 來源: 世界杯賽程預測 導刊

UPLC-MS/MS法測定畜肉中萊克多巴胺
覃弘毅
（南寧市食品藥品檢驗所，廣西南寧 530000）
作者簡介：覃弘毅（1992—），男，壯族，廣西河池人，本科，助理工程師。研究方向：食品質量安全檢測。
摘 要：建立了超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）測定畜肉中萊克多巴胺的分析方法，樣品經提取後通過PCX固相萃取柱淨化。經C18色譜柱分離後，通過電噴霧離子源正離子模式（ESI+）進行多重反應離子監測（MRM）。以內標法定量。結果表明，萊克多巴胺的線性範圍為0.5～10.0 ng/mL，相關係數r為0.999 77，定量限為0.25 μg/kg，加標回收率在100.2%～105.6%，相對標準偏差RSD（n=6）為4.0%～5.4%。本方法靈敏度高、操作簡單、檢測結果準確，可用於畜肉中萊克多巴胺的定量及確證分析。
關鍵詞：畜肉；萊克多巴胺；超高效液相色譜-串聯質譜
萊克多巴胺是一種人工合成的β-腎上腺受體激動劑，在臨床上主要用於治療支氣管哮喘、充血性心力衰竭症和肌肉萎縮症等。在飼料中添加萊克多巴胺可使動物快速增長，減少脂肪含量，提高瘦肉率。2021年的3·15晚會曝光河北滄州青縣“瘦肉精”羊肉流入鄭州的2022世界杯預選賽最新排名 ，其中檢出的“瘦肉精”就是萊克多巴胺。若此類肉製品被消費者所食用，會對其身體健康造成損害[1]。
目前我國主要推薦使用GB/T 22286—2008進行畜肉中萊克多巴胺的監督抽檢，但標準中實驗步驟相對繁雜，耗時較長，對於技術人員實驗操作要求較高。為此，需建立一種穩定性、重複性好，且效率較高的測定方法[2-4]。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
萊克多巴胺標準溶液（100 μg/mL，Alta）、萊克多巴胺D3標準溶液（100 μg/mL，Alta），PCX固相萃取柱
（60 mg/3 mL，Agela）、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶
（100 000 units，CNW）、甲醇（HPLC級，Merck）、乙腈（HPLC級，Merck）、乙酸銨（HPLC級，CNW）、甲酸（HPLC級，CNW）、氨水（HPLC級，CNW）、超純水（Milli-Q製備）
1.2 儀器與設備
AB Sciex TripleQuad 4500三重四極杆質譜儀、Agilent Infinity 1290II超高效液相色譜儀、IKA MS3渦旋振蕩器、Sigma 2-16 KL冷凍離心機、Biotage TurboVap 全自動樣品濃縮儀、梅特勒 XS205DU電子天平
1.3 樣品處理
稱取2 g試樣於50 mL離心管中，加入8 mL乙酸銨溶液（pH=5.2），混勻，再加入100 μL內標溶液（100 ng/mL）和50 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，於37 ℃下振蕩16 h。再加入高氯酸調節pH值到1.0，於8 000 r/min下離心5 min，取全部上清液過PCX柱（依次用3 mL甲醇、
3 mL水活化平衡），控製流速在3 mL/min，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，抽幹，用2 mL5%氨水甲醇洗脫。洗脫液於50 ℃下氮吹至幹，加入1 mL5%甲醇水溶液，渦旋10 s混勻，過0.22 μm濾膜，上機處理。
1.4 儀器條件
1.4.1　色譜條件
色譜柱：Agilent Eclipse plus（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：35 ℃；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：
0～1 min，90%A；1～1.1 min，90%～80%A；1.1～2.2 min，80%A；2.2～2.8 min，80%～5%A；2.8～3.3 min，5%A；3.3～3.4 min，5%～90%A；3.4～4.0 min，90%A。
1.4.2　質譜條件
離子源：電噴霧離子源（ESI+）；掃描模式：多反應離子監測（MRM）；溫度（TEM）：550 ℃；噴霧電壓（IS）：5 500 V；氣簾氣（CUR）：30 psi；霧化氣（GS1）：55 psi；輔助加熱氣（GS2）：55 psi。萊克多巴胺及其內標的質譜參數見表1，萊克多巴胺及其內標的提取離子色譜圖見圖1。
2 結果與分析
2.1 內標的選擇
在現行標準中使用較多的GB/T 22286—2008，采用沙丁胺醇D3作為萊克多巴胺的內標進行計算。然而由於性質上存在差異，其回收率不高，且不穩定，因此本次實驗采用萊克多巴胺的同位素氘代物作為內標，其在性質上更接近本體，因此回收率更好、更加穩定。
2.2 前處理條件的優化
GB/T 22286—2008實驗步驟中，經高氯酸調節pH後的樣品溶液，需使用氫氧化鈉溶液調節pH，使萊克多巴胺轉化為分子態，再經異丙醇-乙酸乙酯溶液萃取濃縮，複溶後作為固相萃取上樣溶液。本次實驗直接使用經高氯酸調節pH後的樣品溶液作為上樣溶液，省去了國標方法中的後續步驟，節省前處理時間。根據實驗原理，高氯酸調節pH為酸性後，萊克多巴胺已成離子狀態[5]，滿足PCX對上樣溶液中目標物形態的要求，確保能夠吸附目標物。實驗結果表明，該方法的靈敏度及準確度也未受到明顯影響。
2.3 線性範圍、定量限、回收率和精密度
精密移取萊克多巴胺和萊克多巴胺D3標準品溶液適量，相應稀釋成0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、
5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，其中各工作曲線溶液中內標的濃度為10 ng/mL。依次上機測定，擬合線性回歸方程見圖2，為y=0.201 89x-7.582 13×10-4。
在空白樣品中加入適量標準品溶液。經測定後，以滿足信噪比（S/N）＞10且添加回收率RSD（n=6）≤20%的最小加標水平作為本方法的定量限（LOQ）。分別按LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ這3個加標水平進行加標實驗，每個濃度水平設置6個平行試樣，結果均滿足GB/T 27404—2008中關於方法確認的要求[6]，詳見表2。
2.4 實際樣品測定
取100份樣品作為實際樣品測試，其中50份為豬肉、30份為牛肉、10份為羊肉、10份為豬肝，均未檢出萊克多巴胺。盲樣測試結果為4.82 μg/kg，準確度為109%。
3 結論
本文以常見畜肉為分析樣本，建立了以萊克多巴胺為分析目標物的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法準確度高、重複性好、穩定、快捷、定量限滿足國家標準要求。在實際應用中，可為在畜肉中非法添加萊克多巴胺的 世界杯賽程預測處置工作提供高通量的技術手段。
參考文獻
[1]佚名.食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單[N].中國 世界杯賽程預測報,2011-04-26(A3).
[2]潘勝東,葉美君,王立,等.混合型陽離子交換固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定肉樣中特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克倫特羅殘留[J].中國衛生檢驗雜誌,2018,28(23):2841-2844.
[3]馬月姣,梁雪燕,孫曉娟,等.萊克多巴胺檢測方法研究進展[A].中國畜牧獸醫學會獸醫藥理毒理學分會.[C]//中國畜牧獸醫學會獸醫藥理毒理學分會第十五次學術討論會論文集.北京:中國畜牧獸醫學會,2019:3.
[4]國家質量監督檢驗檢疫總局.動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法:GB/T 22286—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.
[5]陳小華,汪群傑.固相萃取技術與應用[M].北京:科學出版社,2010.
[6]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.實驗室質量控製規範 食品理化檢測:GB/T 27404—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.
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