分光光度法測定發酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量

摘 要：建立發酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量的測定方法，為優選發酵型枸杞酒提供依據。枸杞多糖在80%（體積分數）乙醇溶液中沉澱，與溶液中單糖和低聚糖分離，與苯酚-硫酸反應，用分光光度法於485 nm處測定其含量，其顯色強度與含量成正比，計算發酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量。該方法的線性範圍在0.010 5～0.104 6 mg，具有良好的線性關係，相關係數為0.999 1，回收率範圍為92%～106%，相對標準偏差範圍為1.9%～3.5%，檢出限為0.8 mg/100 mL，定量限為2.4 mg/100 mL。該方法操作簡單，顯色穩定，靈敏度高，重現性好，適合發酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的測定。
關鍵詞：枸杞多糖；發酵型枸杞酒；分光光度法
枸杞多糖作為一種天然植物多糖，具有重要的生物活性，具有免疫調節、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗炎鎮痛、抗疲勞、神經保護及生殖功能保護等作用[1-3]。枸杞多糖作為發酵型枸杞酒中的重要功能成分，對其含量進行檢測很有必要。目前測定多糖的標準主要采用葡萄糖作為標準物質，苯酚-硫酸法進行樣品前處理，分光光度法進行測定，但這些標準方法不適用於測定發酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量[4-6]。由於選擇葡萄糖作為標準物質時，需進行係數換算，本方法直接選用葡聚糖作為標準物質。本方法主要從苯酚用量、硫酸用量、檢測波長3個方麵進行實驗比較，得到最佳的檢測方法，為優選發酵型枸杞酒提供依據。
1 材料和方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 試劑
濃硫酸（比重1.84）；標準物質：葡聚糖（CAS號9004-54-0）；苯酚溶液（50 g/L）：稱取精製苯酚5.0 g，加水溶解並稀釋至100 mL，混勻；無水乙醇；80%（V/V）乙醇溶液：20 mL水中加入無水乙醇80 mL，混勻。
1.1.2 儀器與設備
分光光度計、離心機（3 000 r/min）、50 mL離心管等。
1.2 方法
1.2.1 標準曲線的繪製
（1）儲備液的配製。準確稱取相對分子質量5×105已幹燥恒重的葡聚糖標準品0.104 6 g，加水溶解，並定容至100 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含有1.046 mg葡聚糖。
（2）標準曲線的繪製。吸取葡聚糖標準儲備液10.00 mL，置於100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含有葡聚糖0.104 6 mg葡聚糖。準確吸取此標準使用液0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL和1.00 mL分別置於25 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入濃硫酸10.0 mL，搖勻後放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻後於485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度，以葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪製標準曲線。
1.2.2 樣品溶液的製備及測定
（1）沉澱枸杞多糖。移取5.00 mL試樣於50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min後，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用10 mL 80%（體積分數）乙醇溶液洗滌，離心後棄去上清液，反複操作4次。殘渣用水溶解並定容至25.00 mL。
（2）樣品的測定。準確吸取樣品測定液2.00 mL置於25 mL具塞試管中，加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入濃硫酸10.0 mL，搖勻後放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻後於485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度，根據標準曲線查出吸取的待測液中葡聚糖的含量，計算樣品中枸杞多糖含量，同時做樣品空白實驗。
2 結果與分析
2.1 苯酚用量的選擇
分別準確吸取5份葡聚糖標準溶液1.00 mL於5支25 mL具塞試管中，再在具塞試管中分別加入0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL的苯酚溶液，各加水至3.0 mL，小心加入濃硫酸10.0 mL，搖勻後放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻後於485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度，選擇較適合苯酚用量。隨著苯酚用量增加吸光值相應增加，在1.0 mL時出現最大值，後隨著苯酚繼續增加吸光值有所下降。因此，最終選擇苯酚用量為1.0 mL。
2.2 硫酸用量的選擇
分別準確吸取5份葡聚糖標準溶液1.00 mL於5支25 mL具塞試管中，各加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入濃硫酸6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL和14.0 mL,搖勻後放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻後於485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定測定吸光度，選擇較適合硫酸用量。隨著硫酸用量增加吸光值相應增加，在10.0 mL時出現最大值，後隨著硫酸繼續增加吸光值有所下降。因此，最終選擇硫酸用量為10.0 mL。
2.3 檢測波長的選擇
取空白對照和樣品溶液，分別經苯酚-硫酸試劑顯色後，用分光光度計在400～800 nm波長範圍內作全波長掃描則定，兩者均在485 nm處有最大吸收，故選擇485 nm作為測定波長。
2.4 線性範圍及檢出限、定量限
標準使用液按1.2.2進行測定，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製標準曲線，標準曲線、相關係數、檢出限和定量限見表1。 2.5 方法的準確度和精密度
準確稱取相對分子質量5×105已幹燥恒重的葡聚糖標準品0.104 6 g，加水溶解並定容至100 mL，混勻，分別取濃度為1.046 mg/L的葡聚糖標準溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL加入預先加入5.00 mL樣液的50 mL的離心管中，其餘按上述樣品的製備及測定操作，根據標準曲線查出吸取的待測液中葡聚糖的質量。其中加標濃度為5.23 mg/100 mL、10.46 mg/100 mL及20.92 mg/mL的測定用所試樣測定液的體積為1.0 mL，使其濃度處於標準曲線範圍內。進行3個濃度水平的試驗，每個濃度水平需要獨立檢測6次。結果見表2。回收率範圍為92%～106%，相對標準偏差範圍為1.9%～3.5%。 2.6 實際樣品的測定
用本實驗方法對7個發酵型枸杞酒樣品進行測定分析，每個樣品重複測定2次。檢測結果見表3。 3 結論
本研究采用乙醇溶液除去單糖、低聚糖、甙類及生物堿等幹擾性成分。用水溶解乙醇沉澱物中所含的多糖類成分。多糖類成分在硫酸作用下，先水解成單糖，並迅速脫水生成糖醛衍生物，然後和苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法於485 nm波長處測定其多糖含量。
采用苯酚-硫酸比色法測定發酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的最佳顯色條件為苯酚溶液（50 g/L）用量1.0 mL，硫酸用量10.0 mL，搖勻後放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻後於485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度。通過加樣回收率試驗和精密度試驗，回收率範圍為92%～106%，相對標準偏差範圍為1.9%～3.5%。表明采用此方法檢測發酵型枸杞酒中枸杞多糖含量準確度高、精密度好、加樣回收率高，本方法適合於發酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的測定。
參考文獻
[1]馬倩倩,李駿,張鬆傑,等.枸杞多糖生物活性的研究進展[J].農產品加工(下),2017(7):59-61.
[2]石振萍,蔣朝輝,梁卿,等.枸杞多糖結構及藥理作用研究進展[J].甘肅中醫藥大學學報.2021,38(2):90-95.
[3]張雅莉，等.枸杞多糖的抗氧化及緩解體力疲勞作用研究進展[J].上海交通大學學報(醫學版).2015,35(6):911-914.
[4]中華人民共和國工業和信息化部.枸杞多糖:QB/T 5176—2017[S].北京:中國輕工業出版社,2017.
[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.枸杞:GB/T 18672—2014[S].北京:中國標準出版社,2014.
[6]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法:SN/T 4260—2015[S].北京:中國標準出版社,2015.
作者簡介：韓秋珍（1989—），女，漢族，廣東廣州人，本科，工程師。研究方向：食品檢測與標準化。