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一種氯黴素高靈敏消線法檢測試紙條的製備

2021-08-20 23:08:20 來源:

　　一種氯黴素高靈敏消線法檢測試紙條的製備
　　寧軍1，李 娜 2、嚴雨倩2，付 麟2，周興華2
　　（1.廣東精捷檢驗檢測有限公司，廣東雲浮 527400;2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）
　　摘 要∶本文對氯黴素進行丁二酸酐衍生得到半抗原，將半抗原與載體蛋白 BSA偶聯作為免疫原，氯黴素與偶連載體蛋白 0VA作為篩選抗原，獲得氯黴素單克隆抗體，IC。值為0.010 6 ng/mL，線性範圍為 0.002 3～0.0495 ng/mL，特異性好，與相關藥物沒有交叉。在此抗原抗體的基礎上製備膠體金試紙條，對雞肉樣本進行添加回收試驗，消線法檢測限為0.1μg/kg，與目前市場上主流的比色法判讀試紙條相比，消線法判讀更加快速，不需要使用讀數儀輔助判讀，為農產品質量安全提供有力保障。
　　關鍵詞∶氯黴素;單克隆抗體;膠體金免疫層析試紙條;消線法;檢測
　　氯黴素(Chloramphenicol, CAP)是一種廣譜抗生素，對 革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑製作用。長期食用含有 氯黴素的雞肉組織會擾亂人體正常的生理功能，引起再生障 礙性貧血。農業部第250號公告中明確規定氯黴素及其鹽、 酯在動物性食品中禁止使用，所以測定動物組織中氯黴素殘 留含量具有重要的意義。目前動物性食品中氯黴素殘留檢測 方法有免疫分析方法、質譜法等。免疫學方法是農產品中抗 生素殘留檢測中最重要的檢測技術之一，具有成本低、操作 簡便、快速等優點，不需要輔助儀器，更適合大量樣本的初 篩檢測。目前市場上的氯黴素試紙條，靈敏度不夠高，基本 上都是釆用比色判讀方法，試紙條上控製線和檢測線差異不 大，判讀結果爭議較大。本研究製備的氯黴素試紙條，靈敏 度高，可以釆用消線法判讀，判讀更加快速、準確，為農產 品質量安全提供有力保障『％
　　1材料與方法
　　1.1試劑與藥品
　　氯黴素標準品，購買自百靈威科技有限公司；牛血清白 蛋白(BSA)、水溶性碳二亞胺鹽酸鹽(EDC HCL)、N-羥 基琥珀酰亞胺(NHS)、3,3',5,5，-四甲基聯苯胺(TMB)、 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇溶液(50% PEG solution(w/v))、辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗、 羊抗鼠抗體IgG購買自武漢博士德公司；新西蘭胎牛血清， 細胞基礎培養液RPMI 1640,選擇性培養基HAT(50x)、 HT(100x),購買自Gibco公司；膠體金試紙條底板(PVC 材質)，硝酸纖維素膜(NC膜)，吸水墊和樣品墊均購買 自Goldbio科技有限公司；其他實驗室常用試劑均為國產分 析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司；陰性雞肉樣本 由溫氏集團檢測中心提供。
　　1.2儀器與設備
　　台式高速(冷凍)離心機，湘儀儀器；高壓蒸汽滅菌鍋 (MLS-375 1L-PC),鬆下健康醫療器械株式會社；磁力攪 拌器(Big Squid),德國IKA；純水機(20 TB),賽飛(中國) 有限公司；液氮罐，成都金鳳液氮容器有限公司；酶標儀、 3111型加水套CO2培養箱、紫外-可見分光光度計Biomate 3S, Thermo Fisher Sciencetific 公司潔淨工作台(BCM-1300A), 蘇淨安泰空氣技術有限公司；數顯恒溫水浴鍋(HH-2),江 蘇金怡儀器科技有限公司；倒置顯微鏡(XD-202),南京江 南永新光學有限公司；金標滑膜儀、切條機，上海金標生物 科技有限公司。
　　1.3實驗動物和細胞
　　實驗動物：SPF級BALB/c小鼠，6 ~ 8周齡，雌性， 揚州大學醫學中心；實驗細胞：SP 2/0細胞，中國科學院上 海生命科學研究院。
　　1.4試驗方法
　　1.4.1半抗原衍生
　　氯黴素分子表麵有兩個自由羥基，一個伯羥基，一個仲 羥基。伯羥基可以與丁二酸酊反應生成梭酸，可與蛋白偶連。 5.5 mg氯黴素溶解於0.5mLtt®中，加入4.2mgDMAP 與2 mg 丁二酸酊，50P磁力攪拌反應4h,得到衍生產物 CAP-COOH.將反應產物氮吹幹，溶解於水中並使用二氯 甲烷萃取2次，將二氯甲烷相合並，氮氣吹幹，得到目標產 物曠71。衍生步驟如圖1所示。
　　1.4.2完全抗原的合成
　　（1） 免疫原合成方法。2 mg的CAP-COOH半抗原溶解 於400 hL DMF溶液中，加入1.1 mg NHS與1.8 mg碳二亞 胺EDC,室溫條件下磁力攪拌反應2 h,得到活性酯。隨後 將活性酯逐滴加到5 mg BSA溶液中，室溫磁力攪拌過夜。 將最終產物裝入透析袋中，在0.05 mol/L PBS溶液中透析 3d,每4〜8h更換一次透析液。透析結束後分裝小份， -20 °C保存[8_10]o
　　（2） 包被原合成方法。氯黴素上遊離的羥基通過CDI法 與蛋白偶聯，3 mg CAP溶解於0.5 mL無水DMSO試劑中， 加入2mgCDL室溫磁力攪拌反應20 min。向反應液中加 入100 uL超純水終止反應。隨後將活化產物逐滴加到5 mg OVA蛋白溶液，室溫條件下磁力攪拌反應4 h。偶聯產物在 0.05 mol/L PBS溶液中透析3d,每4〜8h更換一次透析 液凹。透析結束後分裝小份，-20 P保存。
　　1.4.3小鼠免疫及血清篩選
　　使用合成的完全抗原CAP-COOH-EDC-BSA作為免疫 原進行小鼠免疫實驗，CAP-CDI-OVA作為包被原進行篩選 實驗。每個免疫原選取4 H BALB/c小鼠進行免疫。釆用間 接競爭ELISA方法[12-13]測定小鼠血清效價與抑製效果，具 體步驟如下。
　　（1） 包板。用包被緩衝液將包被原（CAP-CDI-OVA）稀釋 到適宜濃度，加入到96孔酶標板（100 J1L/孔）中，37。（2下 孵育2h。孵育結束後甩出酶標板中液體，加入洗滌緩衝液 （含 0.05% 吐溫 20 的 0.01 mol/L PBS, 200 gL/ 孔），靜止 3 min後甩出，拍幹，重複洗滌3次，拍幹。
　　（2） 封閉。每孔中加入200 gL封閉液，4。（3過夜，洗滌 液改為250pL洗滌3次，拍幹。
　　（3） -抗。使用棋盤法同時測定小鼠的血清效價與抑 製。使用洗滌緩衝液作為陰性對照（50 nL/孔）,檢測組加 入適宜濃度的標準品溶液（50 jxL/孔）。處理好的小鼠血清從 1 000倍用抗體稀釋液進行梯度稀釋（1 000> 3 000> 9 000> 27 000倍），分別對應加入對照組與檢測組中，37P下孵 育30tnm,洗滌3次同上，拍幹。
　　（4） 二抗。將HRP二抗用洗滌緩衝液稀釋3 000倍，然 後每孔加入100 gL,37 °C下反應30 min,洗滌3次同上，拍幹。
　　（5） 顯色。使用前將A液與B液按1 ： 1配製，混勻後 加入酶標板（100 pL/孔）,37 °C下避光顯色15 min。
　　（6） 終止。酶標板中每孔加入50 nL終止液，使用酶標 儀測量450 nm、620 nm下吸光值，最終結果按照OD頌皿- OD620mn保存數據。
　　1.4.4細胞融合及抗體製備
　　篩選效果較好的小鼠進行細胞融合試驗。①SP 2/0細胞 的複蘇與擴大培養；②小鼠脾髒細胞融合。小鼠脾細胞與 SP2/0細胞混合均勻，比例為5 : 1,釆用PEG 1500進行 細胞融合試驗；③雜交瘤細胞的培養與篩選。細胞融合後第 7 d進行細胞上清檢測，挑選OD值高，抑製率高的孔進行 亞克隆，使用有限稀釋法進行3次亞克隆，挑選出單團雜交 瘤細胞轉移至培養瓶中進行擴大培養，最後轉移至液氮儲存 箱中保存叫
　　釆取體內誘生腹水瘤法製備細胞株腹水抗體，再使用辛 酸-硫酸鉉法進行抗體純化[11]=
　　1.4.5單克隆抗體的評價
　　釆用間接競爭法，分別測定所製備單克隆抗體對氯黴素 與其結構類似物（氟苯尼考、甲硯黴素）的值。交叉反 應率（Cross-reactivity, CR, %）=（氯黴素 /C50 值 / 類似物
　　值）xi00%[6113]o
　　1.4.6膠體金試紙條的製備
　　按照檸檬酸三鈉還原法製備金納米粒子，釆用O.lmol/L 碳酸鉀溶液進行抗體標記，標記量分別為6 pg/mL、8 gg/mL, 10 p.g/mL 和 12 pg/mL, 10% BSA 封閉，0.01 mol/L pH 8.5 硼酸緩衝液（含0.25% BSA, 3%海藻糖，1%吐溫20）複溶， 按照50 nL每孔加入到微孔板中，凍幹，密封保存。
　　試紙條主要由PVC底板，NC膜，樣品墊和吸水紙組成。 將羊抗鼠抗體（靠吸水紙端）和抗原（靠樣品墊端）按照一定的 濃度劃到硝酸纖維膜上，分別構成試紙條質控線（C線）和檢 測線（T線）,隨後將試紙條在37P下烘箱中烘幹過夜us， 在靠近C端貼上吸水紙，靠近T線端貼好樣品墊。切成4 mm 寬度。檢測時，將待檢測液體加入微孔中，反應3 min後， 插入試紙條，5mhi後判讀。
　　1.4.7添加回收試驗
　　對雞肉陰性樣本進行氯黴素添加回收試驗。陰性對照組 添加不含標準品空白溶劑作為對照。具體操作如下：取4g 均質後的樣品，添標濃度分別為0、0.05 pg/kg、0.10 gg/kg 和0.20 gg/kg,加入7 mL乙酸乙酯，劇烈振蕩5 min, 4 000轉離心5 min。取4mL上清，氮氣65。（3吹幹後，再 加入2 mL正己烷和0.4 mL 0.01 mol/L PBS,振蕩1 min,離 心3 min,去除上層，取下層溶液100 gL點樣。
　　2結果與分析
　　2.1完全抗原的合成與表征
　　氯黴素半抗原、載體蛋白（BSA和OVA）及合成的免疫 抗原和包被抗原分別使用0.01 moVL PBS稀釋至合適的濃 度，使用紫外-可見分光光度計在200〜450 nm範圍內進 行掃描，結果如圖2所示。
　　如圖2所示，兩種載體蛋白的紫外特征峰均位於278 nm 左右，偶聯物CAP-COOH-EDC-BSA紫外吸收較同濃度的 BSA有明顯增強且有略微偏移。同樣，偶聯物CAP-CDI- OVA紫外吸收較同濃度OVA也有明顯增強，紫外表征結果 顯示氯黴素半抗原成功的與載體蛋白進行了偶聯。
　　2.2單克隆抗體的評價
　　通過對小鼠血清進行ELISA檢測，篩選效價高、抑製 率高的小鼠進行細胞融合實驗。通過陽性篩選與3次亞克隆, 得到針對氯黴素的雜交瘤細胞株（6E2）,並製取腹水，純 化後得到氯黴素單克隆抗體[11]
　　釆用棋盤法，篩選出氯黴素單克隆抗體的最佳工作點， 即包被濃度0.03卩g/mL、抗體濃度0.25卩g/mL,然後以不同 濃度的氯黴素標準品溶液(0、0.003 ng/mL、0.010 ng/mL、 0.030 ng/mL、0.090 ng/mL 和 0.270 ng/mL)建立標準曲線， 其標準曲線如圖3所示，其雲爲值為0.010 6 ng/mL,線性 範圍CIG。〜IC80)為0.002 3〜0.049 5 ng/mL,相關係數 為 0.999 Oo
　　通過ic-ELISA方法測定氯黴素單克隆抗體的交叉反應， 檢測結果如表1所示，氯黴素單克隆抗體具有特異性，對氟 苯尼考和甲颯黴素交叉均在1%以下。
　　2.3膠體金試紙條的製備
　　使用不同包被濃度和抗體標記量進行試驗，確定最優條 件C線劃膜濃度為0.5 mg/mL、T線劃膜濃度為0.2 ing/mL 和抗體標記量為10|ig/mL。如圖4所示，使用肉眼觀察時， 氯黴素金標試紙條消線值為0.1卩g/kg。
　　2.4實際樣本添加回收試驗
　　采用以上前處理方法，使用陰性樣品添加試驗確定該 方法靈敏度。4種陰性雞肉樣品氯黴素添加水平為0、0.05g/kg、0.10μg/kg、0.20 μg/kg。結果如圖5所示，使用肉
　　眼觀察時，氯黴素消線法的檢測限為0.1 μg/kg。
　　3 結論
　　本文采用一種完全抗原對小鼠進行免疫，成功製備了一種氯黴素單克隆抗體，ICso值為0.0106ng/mL,特異性好，與相關藥物沒有交叉。在此抗原抗體的基礎上製備膠體金試紙條，對雞肉組織樣本做了添加回收試驗，消線法檢測限為0.1 μg/kg,該方法成本低、靈敏度好、操作方便快速，判讀方式簡單，對雞肉中氯黴素殘留的監控有重要意義。
　　參考文獻
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