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串聯質譜法快速測定養殖魚中的乙氧基喹啉

2021-08-15 21:25:59 來源:

　　QuEChERS提取一EMR淨化-高效液相色譜一
　　串聯質譜法快速測定養殖魚中的乙氧基喹啉
　　陳琳珊 12陳佩佩 1，2，何雯倩1.3，陳 茹1.3
　　（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東廣州 511442;2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東廣州 511442;
　　3.廣東省質量監督食品檢驗站，廣東廣州 511442）
　　作者簡介∶陳琳珊（1987—），女，漢族，廣東台山人，大專，助理工程師。研究方向∶食品分析檢測。
　　摘 要∶建立了高效液相色譜-串聯質譜法對養殖魚中的乙氧基喹啉進行快速測定。基於QuEChERS技術，樣品用乙腈和水提取，鹽析分層離心。經增強型基質去除固相吸附劑（（Enhanced Matrix Removal，EMR）淨化後，通過電噴霧電離源（Electrospray Source Ionization，ESI）的正離子模式電離，結合多反應監測（Multiple Response Monitoring，MRM）進行采集。乙氧基喹啉標準曲線在1.0～200 μg/L範圍內呈良好線性關係，相關係數r>0.999 6，平均回收率為82.9??105.0??方法檢出限為10.0 μg/kg，方法定量限為 30.0 ug/kg，相對標準偏差RSDs為4. 64% ~ 5. 96%。該方法簡單快捷，回收率良好、靈敏度高和重現性好，可應用於實際養殖魚中乙氧基喹啉的快速測定。
　　關鍵詞∶超高效液相色譜-串聯質譜法;快速測定;水產品;乙氧基喹啉
　　乙氧基哇咻(Ethoxyquin, EQ)是一種經化學合成的芳香 胺，結構如圖1所示，呈油狀液體，具有清除自由基從而防 止脂質氧化的作用，同時對蛋白質、維生素等物質也有很好 的抗氧化效果E,因此在飼料產品市場中應用廣泛。有研究 表明，一定量的乙氧基哇琳對大黃魚、雛雞具有一定的促生 長作用，但過量時會產生抑製生長的作用同時，過量的 乙氧基哇琳會對動物機體產生_定的不良影響，如400 mg/kg 的飼料添加量會使大菱釁降低食量[4],而15 000 mg/kg的添 加量也會使大西洋鍵產生拒食現象按照歐盟規定，2018 年3月31日後不允許飼料產品中有乙氧基哇咻產品添加， 可見乙氧基喳琳的安全性確實存在一定的爭議，而人類作為 水產品的終端消費者，乙氧基喳琳在水產品中的殘留量也會 對人體存在一定的隱患。目前，我國的相關法律法規仍然允 許乙氧基哇琳在飼料中添加使用，由於其效果優異，即使我 國水產品行業禁用後，仍然有可能會存在一段時間的違法濫 用。因此，建立水產品中乙氧基哇哧快速有效的檢測方法具 有極其重要的意義。
　　目前，對水產品中乙氧基喳琳測定方法的相關報道較少, 主要為毛細管電泳法時、高效液相色譜法卩％氣相色譜法㈣、 液相色譜串聯質譜法網、氣相色譜-質譜法凹和高分辨質 譜法回。毛細管電泳法靈敏度高、重現性差，高效液相色 譜法和氣相色譜法則存在選擇性較低的問題，高分辨質譜法 價格昂貴，儀器維護成本高，難以普及，因此這些方法均難 以應用於實際的大批量檢測。而液相色譜串聯質譜法、氣相 色譜-質譜法則具有靈敏度高，選擇性好，應用廣泛的優點, 可用於實際的批量檢測。本文建立的高效液相色譜-串聯質 譜法，基於QuEChERS方法提取，增強型基質去除淨化劑 EMR進行淨化，通過二次優化質譜參數，使目標物達到實 際測定的最佳響應值，結合高效液相色譜，使目標物在短時 間內出峰，且保持良好的峰型。同時方法學實驗數據表明， 該方法可有效測定水產品中的乙氧基喳琳。
　　1材料與試劑
　　1.1儀器與設備
　　高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀，配有電噴霧電離源 (ESI) (API 4000Q, ABSCIEX 公司)；電子天平；4kT5 離心機(北京卓明貿易有限公司)；IKAM)rtex4渦旋混勻器 (廣州儀科實驗室技術有限公司)；Milli-Q去離子水發生器 (美國Millipore公司)。
　　1.2材料與試劑
　　養殖魚樣品，購於廣州市市場。
　　甲酸、乙睛(LC-MS級，美國Thermo Fisher公司)； 乙氧基喳咻標準品(純度>98.5%, SIGMA,購自安譜公司)； EMR淨化管(安捷倫，購自德祥公司)；石墨化炭黑鍵合矽 膠(Graphitizing of Carbon Black. GCB)、十八烷基鍵合矽 膠(CQ、N-丙基乙二胺鍵合矽膠(Primary Secondary Amine, PSA)(購自廣州聯方公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純, 購自安譜公司)。
　　1.3實驗條件
　　1.3.1標準溶液的配製
　　標準溶液：稱取適量標準品，用乙睛溶解並配成濃度為 1 mg/mL的標準儲備溶液，於4 P下避光保存。
　　標準工作溶液：分別準確移取一定體積的標準儲備
　　液，用乙臘重新定容成1.0 Hg/L、2.0 ng/L、5.0 ng/L、 20.0 pg/L, 50.0 gg/L> 100.0 p.g/L和 200.0 gg/L 的標準工作液。 1.3.2樣品處理
　　養殖魚產品先均質處理。稱取均質後樣品2.0 g(精確至 0.01 g),精密稱定於50 mL離心管中，先加入水lOmL, 再加入乙臘10 mL,渦旋混合2 min,然後加入4 g無水硫 酸鎂和lg氯化鈉，渦旋提取15 min, 10 000 r/rnin離心 5 min,離心後取2 mL上清液轉移至15 mL EMR脫脂淨化 管(預先用1 mL水活化2min)中，渦旋2min後，4 500r/min 離心5 min,取1.5 mL上清液於裝有0.5 g無水硫酸鎂的 2 mL離心管中脫水後過膜上機。
　　1.3.3色譜條件
　　色譜柱 Agilentporoshell EC-C18 (150 mm><3.0 mm, 2.7 pm)； 柱溫為40P；進樣量為10pL；流動相A為乙睛，B為0.1%甲酸水(體積分數)；釆用等度洗脫方式洗脫分離：A ： B為80 : 20；流速為 0.40 mL/min；釆集時間：7 min.
　　1.3.4質譜條件
　　離子源：電噴霧電離源(ESI)；電離模式：正離子模 式；離子源溫度為500 °C,離子源電壓為5 000 V。霧化氣 (GAS1) : 50 psi；加熱輔助氣(GAS2) : 50 psi；碰撞氣 (CAD) : medium；釆集模式：多反應監測(MRM)模式。
　　2結果與分析
　　2.1質譜分析條件的確定
　　建立養殖魚中乙氧基喳琳的儀器分析方法，通過流動注 射的方式，將標準溶液直接注入ESI離子源，確定乙氧基哇 咻的母離子質荷比為m/z 218.3,子離子質荷比分別為mlz 148.2 和油174.2,同時優化其去簇電壓DP和碰撞能量CE,得 到最佳的參數條件，見表1。通過優化色譜條件，確定最佳 洗脫流動相比例為乙臘：0.1%甲酸水(80 : 20),流速為 0.40mL/mm»乙氧基哇咻標準品提取離子流色譜圖如圖2所示。

　　2.2分散固相萃取劑類型的選擇
　　在實驗初期，探究了分散固相莘取劑類型對乙氧基喳琳 回收率的影響。由於購買的EMR淨化管中包含了 l.lg的 EMR淨化粉末，為了保證方法的簡便性，不再對用量進行探究，同時，用同樣量的PSA、C”和GCB淨化粉末進行回收 率的對比。分別對每個用量水平重複測定6次，以平均回收 率為考察依據。結果顯示，當用EMR淨化時，乙氧基喳琳 的回收率最高。而且水產品中含有較多的油脂，用EMR淨 化能降低儀器分析時的基質效應。因此，最終選擇EMR為 淨化劑。結果詳見圖3。
　　2.3基質效應
　　養殖魚中基質複雜，對目標物可能存在基質效應，從而 影響目標物在質譜中的離子化程度，因此對乙氧基喳琳的基 質效應(matrix effect, ME)進行了考察。按照前處理方法對 乙氧基喳琳呈陰性的羅非魚進行處理，得到空白基質液，用 此空白基質液配製50 ng/L的單標溶液，按方法的儀器條件 測試，測得值和原濃度比值即為梃,以她作為判斷的依據。 當Affi值在0.8〜1.2時，基質效應不明顯；若Affi值小於0.8, 則說明基質效應為強負效應明顯，大於1.2則為強正效應。 乙氧基喳琳的她計算結果為0.92,說明基質效應不明顯， 這可能是由於EMR淨化了樣品中大部分的油脂。因此，為 了簡化實驗，最終釆用溶劑曲線作為定量曲線。
　　2.4線性關係和檢出限
　　在本方法所確定的實驗條件下，用乙臘將標準溶液稀釋 至 1.0 fig/L、2.0 jig/L、5.0 ng/L, 20.0 pg/L, 50.0 fig/L、100.0 gg/L 和200.0 gg/L進行測定，以峰麵積(Y軸)對相應的濃度(X軸) 作圖，得到線性方程JM.76xl0%3.92xl()3。結果表明，待測 化合物濃度與對應的峰麵積呈現良好的線性關係，相關係數r為0.999 6,具有較準確定量能力。
　　同時，通過對羅非魚樣品進行低濃度水平加標，再分別按信噪比的3倍(S//3)和10倍(S/AM0),得出方法檢出 限(LOD)和定量限(AOQ)。結果表明，乙氧基喳咻的方法檢 出限為10.0ng/kg,定量限為30.0pig/kg,表明方法具有較 高的靈敏度。
　　2.5回收率與精密度實驗
　　選取均質後的樣品初步平均測定3次，確定其本底值， 再進行加標回收實驗，結果見表3。最終選用乙氧基哇琳 呈陰性的羅非魚和黃鰭作為加標回收樣品，按照乙氧基喳 琳定量限的1倍、2倍和5倍水平進行添加，每一個水平 均進行日內重複測定6次(»=6)«最終測得平均回收率在82.9%〜105%,相對標準偏差71SD為4.64%〜5.96%。結果表明，方法回收率良好，精密度好，滿足實驗室的測定要求。
　　3 結論 in the muscle of Atlantic salmon (Salmo salarL.)[J]. Food Chem
　　本文基於QuEChERS技術對樣品進行提取，選用增強 Toxicol, 2008,46(5):1834-1843.
　　型基質去除 EMR 粉末進行分散固相萃取淨化。建立的超高 【6】龐軍，劉文紅，宋合興，等.高效毛細管電泳法同時檢
　　效液相色譜條件使目標物在3 min 內出峰，且峰型良好。通 測飼料中六種抗氧化劑 【J】.中國飼料，2013（8））∶40-42.
　　過流動注射混合流動相的方式，二次優化目標物的質譜參 【7】餘曉琴，李澍才，唐昌雲.高效液相色譜-熒光檢測法
　　數，提高了目標物的靈敏度。通過方法學實驗驗證了方法的 測定水果中乙氧基喹啉【J】.分析測試學報，2019.38（10）∶1260-1264.
　　可行性，結果表明，該方法回收率良好，靈敏度高，重複性 【8】舒曉夢，趙素娟，王羚佳，等.高效液相熒光法測定豬
　　好。在實際的樣品測定實驗中，能有效檢測出實際陽性樣品， 肉中抗氧化劑乙氧基喹啉以及代謝產物二聚乙氧基喹啉【J】.食
　　因此，可應用於日常實驗室的檢測中，同時也為後續的相關 品與發酵工業，2018，44（5）∶244-248.
　　研究提供了參考依據。 [9]RODRiGUEZ-GOMEZ R, VANDEPUT M,ZAFRA-
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