超高效液相色譜一串聯質譜法檢測食品中15種真菌毒素含量

2021-08-15 21:18:56 來源:

　　超高效液相色譜一串聯質譜法檢測食品中15種

　　真菌毒素含量

　　鄧新煜1，張健希'2，張京華1

　　（1.遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110026;2.盤錦市檢驗檢測中心，遼寧盤錦 124000）

　　摘要∶目的∶建立超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem MassSpectrometry，UPLC-MS/MS）同時測定食品中 15種真菌毒素的方法。方法∶ 樣品經 50乙腈水溶液提取後，MycoSpinTM400淨化柱淨化，同位素內標稀釋後，上機測定。結果∶ 在低、中和高水平下，這15種真菌毒素的平均回收率為68.87～109.24??精密度在1.97??12.88??15種真菌毒素在各自的線性範圍內線性關係良好，線性係數均大於0.995，檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.6～ 8.0 μg/kg和1.8～24.0 μg/kg。對生產日期為 2019—2020年的多種類糧油食品進行15種真菌毒素的檢測工作，結果顯示黃曲黴毒素B1和玉米赤黴烯酮的陽性檢出率最高。結論該方法靈敏度高、結果準確可靠，適合於食品中多種真菌毒素的同時快速檢測。

　　關鍵詞∶超高效液相色譜 - 串聯質譜法;食品;真菌毒素

　　真菌毒素是食物或飼料中生長的真菌產生的代謝產物，對人類和動物有害。早在11世紀就出現過真菌毒素中毒事件，麥角菌核中的生物堿是造成中毒的主要原因，因此該病被稱為麥角菌病。麥角急性中毒的症狀是產生幻覺和肌肉痙攣，引起四肢動脈持續收縮和壞死。食用發黴的穀物製成的麵包會引發惡心、嘔吐等症狀。真菌毒素具有高度汙染、劇毒、穩定的理化性質，在食品加工，運輸以及儲存過程中已存在很長時間，很難破壞。其通過受汙染的食物以及飼料直接進入人體以及動物體，或通過動物產品間接進入食物鏈，在人類以及動物體內長期積累可導致神經毒性、致畸性、致腎毒性、致癌性、致突變性以及致細胞毒性。

　　根據汙染的普遍度及毒性危害嚴重性分析，黃曲黴毒素 B]、伏馬毒素B]、玉米赤黴烯酮及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是真菌毒素中具有劇毒且致癌的化學物質，也是近5年國家食品安全監督抽檢中重點監測的檢驗項目。

　　傳統的黴菌毒素檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、酶聯免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)等。這些方法一般隻能針對一種或一類結構類似的毒素進行快速篩選、定性或定量檢測[11«薄層色譜法簡捷、便利，但重現性差、精密度低；酶聯免疫法特異性強、前處理簡單，但假陽性率高，不能作為確證方法；氣質聯用法需要衍生化前處理、操作費時費力図。與其他真菌毒素檢測方法相比，液相色譜- 串聯質譜法，集高效分離和多組分定性與定量檢測於一體，成為近年來黴菌毒素多殘留檢測技術的主流方向。

　　本研究利用Mycospin ™ 400前處理技術加上同位素內標技術，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法 (Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS)同時測定花生、玉米、大豆油等糧油食品中的15種真菌毒素的分析方法，為痕量多種真菌毒素和代謝物的同時檢測提供了一個方便、快速、高效、低成本、高通量、標準化的環境友好型檢測技術手段。

　　1材料與方法

　　1.1儀器與材料

　　美國AB SCIEX 4000Q超髙效液相色譜-串聯質譜儀 (美國Agilent公司)；Milli-Q超純水儀(德國默克密理博公司)；Picol7微量離心機(美國賽默飛世爾公司)； BP211D分析天平(德國賽多利斯公司)；MM400型混合研磨儀(德國RETSCH GmbH)o

　　甲醇、乙睛、乙酸、醋酸：色譜純，德國Merck公司； 15種真菌毒素黃曲黴毒素Bi(AFBD、黃曲黴毒素B2(AFB2), 黃曲黴毒素G (AFGi)、黃曲黴毒素G2 (AFG2)、伏馬菌素Bi (FBD、伏馬菌素B2 (FB2)、伏馬菌素B3 (FB3)、嘔吐毒素(DON)、15-乙酰基嘔吐毒素(15-ACDON)、 3-乙酰基嘔吐毒素(3-ACDON)、T2毒素(T-2)、HT2毒素(HT-2)、玉米赤黴烯酮(ZEN)、赭曲黴毒素A(OTA)、雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)。黃曲黴毒素混標包含Bi、GP濃度為2ng/mL和Bz、G2,濃度為0.5 ng/mL；伏馬毒素混標包含伏馬毒素Bi、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3,濃度均為50 ng/mL；嘔吐毒素、鐮刀菌烯酮、15-乙酰基嘔吐毒素、3-乙酰基嘔吐毒素、T2毒素、HT2毒素、玉米赤黴烯酮、赭曲黴毒素A 濃度均為10 ng/mL,以及6種同位素內標U-LGJ-伏馬毒素Bi (25 ng/mL)、U-F%]-伏馬毒素B?、U-性打-伏馬毒素 B3 濃度為 10 ng/mL、U-[13Cj5]-嘔吐毒素(25 ng/mL)、 U-[13C18]-玉米赤黴烯酮濃度為25颶/mL、U-f13^]-赭曲黴毒素A濃度為10 jig/mL(奧地利ROMER LABS公司)； MycoSpin ™ 400多功能淨化柱(奧地利ROMER LABS公司)。 1.2實驗方法

　　1.2.1標準溶液的配製

　　分別配製正離子標準曲線和負離子標準曲線，75pL不同濃度混標加上75皿同位素內標混標混合後進樣，正、負離子濃度如表1、表2所示印。標準曲線現配現用，如未能及時使用，在-20 °C冰箱最多保存1周。

　　1.2.2樣品前處理

　　稱取試樣(25±0.1) g至250mL三角瓶中，加入100 mL 50%乙臘水溶液，於搖床上(250 r/mim)振搖90 min, 過濾上清液。取10 mL濾液至試管，同時加入500 gL 乙酸渦旋振蕩，混勻後從試管中取750皿樣液加入 MycoSpin ™ 400多功能淨化柱中，蓋上蓋子渦旋振蕩 1 min,待樣液的顏色變成淺藍色，折斷MycoSpin™400多功能淨化柱下端封口，將柱放於離心管，以10 000 r/min離心30 s。離心後濾液存留於離心管內，從離心管中取75 pL 樣液分別加入75 gL正離子內標或75 gL負離子內標，渦旋振蕩20 s,上機進樣叫

　　1.2.3色譜條件

　　色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 um, 2.1 mmx 100 mm；柱溫：40 °C；流速：0.3 mL/min；進樣量： 5hL；流動相A為乙臘溶液，B為0.1%甲酸水(ESI+) /0.01% 氨水溶液(ESI-),梯度洗脫條件如表3所示。

　　1.2.4質譜條件

　　電噴霧離子源(Electrospray ionization, ESI):正離子、負離子分別掃描；離子源溫度：正離子模式600 °C,負離子模式520 °C；氣簾氣：20 psi；碰撞氣：中等；電噴霧電壓：正離子模式：5 500 V,負離子模式：4 500 V； Gasl： 55 psi, Gas2： 50 psi；其他質譜條件參見表4。

　　2結果與分析

　　2.1前處理方法的選擇

　　本研究釆用MycoSpin ™ 400多功能淨化柱，進一步優化提取時間和提取溶劑等條件。釆用MycoSpin ™ 400淨化柱能滿足對所有真菌毒素回收率均能達到70%〜130%。

　　2.2流動相的選擇

　　運用相同的洗脫程序，選擇3種不同的流動相對15種化合物進行分析。結果顯示流動相A設置：乙睛；流動相 B設置：0.1%甲酸水(ESI+) /0.01%氨水溶液(ESI-) , 15 種真菌毒素均有較好的響應。

　　2.3質譜條件的優化

　　本試驗釆用對於極性特征化合物具有良好電離作用的 ESI電離源，將各真菌毒素的高濃度標準溶液釆用單標進樣, 根據已確定的色譜條件，通過比較確定各真菌毒素的離子化模式。在選定的離子化模式基礎上，不斷調節毛細管電壓、錐孔電壓、源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔氣流量等質譜參數來進一步提高各母離子的信號水平[4]»在確定各化合物母離子後，通過掃描方式獲得2個以上的子離子, 在豐度由大到小且避免產生相互幹擾的原則下，每種真菌毒素化合物最終確定了 2個監測離子對。通過15種真菌毒素的多反應監測(Multitude Reaction Mode, MRM)色譜圖，質譜條件可以保證質譜峰的良好峰型和豐度。

　　2.4方法學考察

　　2.4.1線性關係、檢出限以及定量限

　　配製標準溶液，將15種真菌毒素混標和正負離子內標混合，繪製標準曲線，結果見表5。由表5可知，15種真菌毒素在各自的線性範圍內均可得到良好的線性關係，相關係數（產）均能達到0.995以上。真菌毒素的檢出限用3倍信噪比來確定，而定量限則用10倍信噪比來確定，其中，信噪比為S比N的比值。

　　2.4.2回收率和精密度

　　選擇花生、玉米、小米、慧米和花生油等不同基質的樣品，檢査15種真菌毒素在低、中和高濃度下的回收率。結果見表6。在低、中和高水平下，這15種真菌毒素的平均回收率為68.87%〜109.24%,精密度在1.97%〜12.88%。 2.5食品檢測中的應用

　　通過文獻搜索和過去3年來自國家市場監督管理總局公示的不合格樣品信息，選定生產日期為2019—2020年，標識生產者地址為廣西、上海、浙江、江蘇、遼寧和四川等地的150 批次食品樣品，地區類型包括城市、農村地區、風景名勝旅遊區和校園周邊。釆樣環節包括常規釆樣、農產品釆樣和網絡釆樣。抽樣地點包括農貿市場、雜貨店、超級市場和網絡購物。樣品種廂花生、球、慧米、小米、花生油、大豆油、甜麵醬、番茄醬、芝麻醬、醬油。釆用建立的UPLC-MS/MS的方法對150份上述類別中的10種食品進行檢測，結果見表7。

　　由表7可知，花生油中黃曲黴毒素B］陽性檢出率最高，高達32.00%,慧米的玉米赤黴烯酮陽性檢出率較高，高達 31.81%,而玉米的玉米赤黴烯酮陽性率也達到15.00%,這可能是由於鐮刀菌屬的菌株易在惹米和玉米作物中生長繁殖，且常存在多種毒素同時並存的情況，比如部分花生樣品中同時含有黃曲黴毒素B］和伏馬毒素B］,部分花生油同時檢出黃曲黴毒素B］和黃曲黴毒素B2.

　　3結語

　　本研究基於MycoSpin ™ 400前處理技術以及同位素內標稀釋技術，結合超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立了一種糧油食品中15種真菌毒素的檢測 g 1次預處理以及1次進樣即可同時檢測食物中多種真菌毒素。同時，運用定性以及定量離子進行蛔捷、頗、低赫、高性能、高標準、

　　環保、靈敏度高、結果準確可靠，可同時檢測痕量不同的真菌毒素和代謝產物，適用於食品中多種真菌毒素的同時檢測。

　　參考文獻

　　[1]王瑞國，蘇曉鷗，程芳芳，等.液相色譜-串聯質譜法測定飼料原料中26種黴菌毒素[J],分析化學2015,43(2):264270.

　　[2]馬帥，王蒙，韓平，等,QuEChERS-超高效液相色譜- 串聯質譜法在食品真菌毒素檢測中應用的研究進展[J].食品安全質量檢測學報,2016,7(8):3020-3024.

　　[3]張大偉，高和楊，周旌，等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測飼料原料、飼料成品中18種真菌毒素含量[J]. 世界杯賽程預測質量檢測學報,2018,9(22):5867-5876.

　　[4]劉家陽，張月輝，賈宏新.凝膠滲透色譜淨化-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測玉米粉中10種真菌毒素[J]. 中國食品衛生雜誌＞2016,28(6):763-768.

世界杯賽程預測新動向

食品產品責任糾

同心同德謀良策

舞鋼市市場監管

【食安直播課】

《世界杯賽程預測最佳

超高效液相色譜一串聯質譜法檢測食品中15種真菌毒素含量

熱點推薦

特醫食品不是藥，卻是臨床治療的關鍵支撐

全十紅紅稗餅幹|中秋團圓，回家必備

和汪氏蜂蜜共同來普及蜂蜜結晶現象

拿坡海開啟西餐加盟新潮流, 大眾化家庭小西餐成未來新趨勢