食品中金黃色葡萄球菌檢測能力驗證的結果與分析

2021-08-15 17:40:46 來源:

　　食品中金黃色葡萄球菌檢測能力

　　驗證的結果與分析

　　董慧明

　　（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110036））

　　摘要∶為提高微生物實驗室金黃色葡萄球菌的檢測能力，於2020年參加乳粉中金黃色葡萄球定量檢測能力驗證，依據《世界杯賽程預測國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》（GB4789.10—2016）進行檢驗。同時應用科瑪喜金黃色葡萄球菌顯色平板和 3M金黃色葡萄球菌測試片作為對照手段進行實驗，並應用VITEK2進行生化鑒定，確保實驗結果的準確性。結果表明，樣品CODE TF02490061結果報告為1 100 CFU/g、樣品CODE TF02490062結果報告為4 800 CFU/g，反饋結果為滿意，z值均<2。

　　關鍵詞∶金黃色葡萄球菌;能力驗證;平板計數

　　金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種食源性病原菌，為無芽苑、無鞭毛的革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌是食品致病菌汙染主要的病原菌，其產生的腸毒素可引起食物中毒，導致腹瀉和上呼吸道感染叫該菌也可以引起局部化膿炎症感染、肺炎、心包炎等，甚至導致敗血症、膿毒症等全身感染㈣。

　　能力驗證活動是利用實驗室間的比對，按照預先製定的準則評價參加者的能力[3]o為有效提高實驗室檢測水平和人員技術能力，遼寧省檢驗檢測認證中心於2020年參加了中國食品藥品檢定研究院組織的乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測（NIFDC-PT-249）能力驗證。

　　1材料與方法

　　1.1樣品

　　待測能力驗證樣品為兩件，每件樣品由1個菌球及相應奶粉組成，編碼分別為CODE TF0249006K CODE TF02490062o在生物安全櫃內將金黃色葡萄球菌樣品的西林瓶打開，將西林瓶內小球加入到225 mL無菌生理鹽水稀釋液中，充分溶解，然後再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述稀釋液中，充分均質混勾。依此方法，分別對2 件樣品進行處理。

　　1.2試劑和儀器

　　金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC6538及表皮葡萄球菌標準菌株ATCC12228,購自廣東環凱微生物有限公司； Baird-Parker平板（B-P平板）、0.85%無菌生理鹽水、平板計數瓊脂（PCA）、革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（BHI）, 均購自北京陸橋技術股份有限公司；凍幹兔血（美國BD公司）；漿金黃色葡萄球菌顯色平板（法國科瑪嘉公司）；金黃色葡萄球菌測試片（美國3M公司）；革蘭氏陽性細菌鑒定卡（GP卡）（法國梅裏埃公司）。

　　A2型生物安全櫃（美國NUAIRE公司）；電熱恒溫培養箱（德國Binder公司）；生物顯微鏡（日本奧林帕斯公司）；高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）；均質器（法國梅裏埃公司）； VITEK2全自動微生物生化鑒定係統（法國梅裏埃公司）。

　　1.3方法

　　依據作業指導書及《世界杯賽程預測國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016） [4]第二法平板計數法進行檢測。同時用科瑪嘉金葡顯色平板和金葡測試片作為對照手段進行實驗，金葡顯色平板每皿接種量為 0.1 mL, 3M金葡測試片每片接種量為1 mL。

　　2結果與分析

　　2.1典型菌落計數

　　金黃色葡萄球菌在B-P平板上呈圓形，表麵光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2〜3 mm,顏色灰黑至黑色，有光澤，周圍有不透明圈（沉澱環），其外有一透明圈（卵磷脂環），菌落有黃油樣粘稠感；在金葡顯色培養基上顯紫紅色，其他菌顯藍綠色或無色；在3M金葡測試片上為紫紅色點，需要確認片進行確認。典型菌落特征見圖1。

　　選擇同一稀釋度所有典型菌落數合計在20〜200 CFU 的平板，計數典型菌落數。金黃色葡萄球菌3種計數方法結果見表1,可見3種方法結果無明顯差異，3個結果都在同一數量級上。

　　2.2確證試驗(鑒定)

　　從 CODETF02490061 和 CODE TF02490062 適宜稀釋度的B-P平板典型菌落中選取5個菌落，分別做革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗，並應用VITEK2進行生化鑒定，確保實驗結果的準確性。

　　2.2.1染色鏡檢

　　取典型菌落進行革蘭氏染色，鏡檢結果為革蘭氏陽性球菌，直徑為0.5〜1.0呻，顯微鏡下排列成葡萄串狀排列。 2.2.2血漿凝固酶試驗

　　挑取B-P平板上典型菌落5個，進行血漿凝固酶試驗，同時以金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉湯培養物作對照，典型菌落和陽性菌株對照血漿凝固酶試驗均在2h產生凝固，陰性菌株對照菌株觀察6 h不產生凝固。典型菌落均為血漿凝固酶陽性，陽性比例為100%。

　　2.2.3 VITEK2生化鑒定

　　將挑取B-P平板上典型菌落劃線接種至PCA平板,36 °C 培養24h,取新鮮培養的菌落進行VITEK2生化儀器鑒定，鑒定結果均為金黃色葡萄球菌，說明B-P平板對金黃色葡萄球菌的選擇性非常好，特征明顯能夠明確區別於其他葡萄球菌。

　　2.3結果報告及反饋

　　以國家標準方法結果為本次能力驗證的報告結果，即證實為金黃色葡萄球菌菌落陽性比例乘以相應稀釋度B-P平板計數典型菌落數，再乘以稀釋倍數，為樣品中金黃色葡萄球菌結果報告數，單位為CFU/g。編號CODE TF02490061 樣品結果報告為1 100 CFU/g,編號CODE TF02490062樣品結果報告為4 800 CFU/g。

　　經能力驗證組織機構反饋，本實驗室CODE TF02490061 金黃色葡萄球菌的檢測結果為3.041,指定值為3.176, z值為-0.5； CODE TF02490062金黃色葡萄球菌的檢測結果為 3.681,指定值為3.712, z值為-0.1； z值均<2,兩個樣品的結果評價為滿意。

　　3結論與討論

　　本能力驗證中釆用多種方法同步進行金黃色葡萄球菌檢測，以保證實驗室檢測結果的準確性。3種計數方法結果無明顯差異，3個結果均在同一數量級上，說明實驗準確無誤，B-P平板與金葡顯色平板計數結果相近，而3M金葡測試片計數結果略低。金葡測試片中相對營養成分較少，且含有抑製其他菌生長的物質明故其檢測結果略低。最後的結果報告以B-P平板上菌落數為主，金葡顯色平板和3M金葡測試片上的菌落數為參考，經反饋兩個樣品的結果評價為滿意。

　　金黃色葡萄球菌檢測的關鍵控製點，①在實驗前將B-P 平板提前放在培養箱中，使平板表麵幹燥。塗布時用L棒小心塗勻，注意不要觸及平板邊緣，塗布後先正置培養，保證水分完全吸收後再倒置培養，以免細菌在平板邊緣縫隙生長，影響觀察計數。②進行血漿凝固酶試驗時，以金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉湯培養物作對照，典型菌落和陽性菌株對照血漿凝固酶試驗應在6h內產生凝固，陰性菌株對照菌株觀察6h不產生凝固，以確保血漿凝固酶試驗準確。

　　參考文獻

　　[1]曾博雅.食品微生物金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證[J],現代食品 >2020(11):176-177.

　　[2]劉雲國. 食品衛生微生物學標準鑒定圖譜[M].北京：科學出版社,2009.

　　[3]中國合格評定國家認可委員會.能力驗證規則:CNAS- RL02:2018[S].北京：中國標準出版社2018.

　　[4]國家食品藥品監督管理總局，國家衛生和計劃生育委員會.世界杯賽程預測國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗:GB 4789.10—2016[S].北京：中國標準出版社,2016.

　　[5]範田麗，付曉靜，吳海江.金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析[J],現代食品,2020(3):196-198.

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